第二节　沼气发酵基本原理

沼气的产生是有机质在隔绝空气和保持一定水分、温度、酸碱度等条件下，经过多种微生物的分解代谢而产生的。因此，沼气发酵过程是一个微生物的过程，参与有机质分解的这些微生物统称为沼气发酵微生物或厌氧消化微生物，这一分解代谢过程叫做沼气发酵（biogas fermentation），又叫厌氧消化（anaerobic digestion）或甲烷发酵（methane fermentation）。

沼气发酵具有如下一些特点：

①沼气发酵微生物自身耗能少，在相同条件下，厌氧代谢所需的能量仅为好氧代谢的1/30～1/20；换句话说，在沼气发酵中，每去除1gCOD大约可获得自由能100～300cal（1cal=4.18J），而在好氧情况下则可获得自由能3000cal以上。

②沼气发酵能够处理高浓度有机废水，其COD可高达10000mg/L以上，而好氧条件下一般只能处理1000mg/L以下。

③沼气发酵微生物对营养要求较低，能处理的有机废弃物多种多样。

④沼气发酵受温度的影响较大。

⑤发酵产物沼气容易从发酵液中分离出来。

沼气发酵技术与普通堆肥发酵方法相比，除能回收甲烷能源外，还具有相当高的保氮作用，其两种代谢机制如图1-3所示。

从图1-3可以看出，堆肥过程却使有机物中的氮素损失，降低了肥效。有机废弃物经过厌氧消化，许多营养成分被激活，更易于作物的吸收和利用，同时，厌氧过程还能有效杀灭各种致病菌、植物病原菌和虫卵，产生的有机肥更为安全。

一、沼气发酵微生物种类

沼气发酵是多种微生物共同代谢的过程，除产甲烷菌外，人们已从沼气池、厌氧消化器、反刍动物瘤胃和活性污泥中分离出了细菌类、真菌类和原生动物类。在有机物的厌氧代谢过程中，不产甲烷菌的研究较为深入，这类细菌参与了沼气发酵过程，并在甲烷的代谢中起着非常重要的作用。真菌和原生动物的作用机制尚不清楚，但一些学者认为它们的作用有时是不可忽视的。

（一）不产甲烷菌

1.细菌

在消化器中存在有大量的厌氧和兼性厌氧细菌，涉及芽孢杆菌属、拟杆菌属、大肠杆菌属、气杆菌属、梭状芽孢杆菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属等19个属50多种，分述如下。

①气杆菌属（Aerobacter）：A.aerogenes

②气单胞菌（Aeromonas）：Aeromonas sp.

③产碱杆菌属（Alcaligenes）：A.bookerii

　　　　　　A.faecalis

　　　　　　A.visolaclis

　　　　　　Alcaligenes sp.

④芽孢杆菌属（Bacillus）：B.cereus

　　　　　　B.cereus var mycoides

　　　　　　B.circulans

　　　　　　B.endorh ythmos

　　　　　　B.firmus

　　　　　　B.ken felkampi

　　　　　　B.megaterium

　　　　　　B.pantothenticus

　　　　　　B.pumilis

　　　　　　B.sphaericus

　　　　　　B.subtilis

　　　　　　Bacillus sp.

⑤拟杆菌属（Bacteroides）：Bacteroides sp.

⑥梭状芽孢杆菌属（Clostridium）：C.aminovaericum

　　　　　　C.carnofoetidum

⑦大肠杆菌属（Escherichia）：E.coli

　　　　　　E.intermedia

　　　　　　Escherichia sp.

⑧克氏杆菌（Klebsiella）：Klebsiella sp.

⑨细螺旋体（Leptos pira）：L.biflexa

　　　　　　Leptospira sp.

⑩小球菌属（Micrococcus）：M.candidus

　　　　　　M.luteus

　　　　　　M.varians

　　　　　　M.ureae

　　　　　　Micrococcus sp.

奈氏球菌属（Nisseria）：N.catarrhalis

副大肠杆菌属（Paracolobacterum）：P.intermedium

　　　　　　P.coloforme

变形杆菌属（Proteus）：P.vulgaris

假单胞菌属（Pseudomonas）：P.aeruginosa

　　　　　　P.ambigua

　　　　　　P.denitri ficans

　　　　　　P.oleoorans

　　　　　　P.perolens

　　　　　　P.pseudomallei

　　　　　　P.reptilivora

　　　　　　P.ribo flavina

　　　　　　Pseudomonas sp.

红极毛杆菌属（Rhodo pseudomonas）：R.palustris

八叠球菌属（Sarcina）：S.cooksonii

　　　　　　S.lutea

赛氏杆菌属（Serratia）：S.indicans

链球菌属（Streptococcus）：S.diploidus

链霉菌属（Streptom yces）：S.bikiniesis

2.真菌

人们已从消化污泥中分离出了藻类、子囊菌和半知菌等30多种真菌，其中的霉菌和酵母菌可能参与消化过程以获得营养，而不仅仅是处于休眠状态。已报道的真菌种类分述如下。

①藻类：毛霉（Mucor）

　　　　根霉（Rhizopus）

　　　　共头霉（Syncephalastrum）

　　　　接霉（Zygorh ynchus）

②子囊菌：Allescheria

　　　　Ascophanus

　　　　Eurotium

　　　　Pseudoplea

　　　　Sartoria

　　　　曲霉（Aspergillus）

　　　　Subbarom yces

　　　　Talarom yces

　　　　腥黑粉菌（Thielavia）

③半知菌：Acremonium

　　　　曲霉（Aspergillus）

　　　　青霉（Penicillium）

　　　　头孢霉（Cephalos porium）

　　　　地霉（Geotrichum）

　　　　胶霉（Gliocladium）

　　　　拟青霉（Paecilom yces）

　　　　帚霉（Scopulariopsis）

　　　　Se pedonium

　　　　穗霉（Spicaria）

　　　　木霉（Trichoderma）

　　　　单端孢霉（Trichothecium）

　　　　交链孢霉（Alternaria）

　　　　芽枝霉（Clados porium）

　　　　Margarinom yces

　　　　Memnoniella

　　　　Humicola

　　　　瓶霉（Phialo phora）

　　　　Pullularia

　　　　葡萄状穗霉（Stach ybotrys）

　　　　附球菌（Epicoccum）

　　　　镰刀菌（Fusarium）

　　　　Myrothecium

3.原生动物

在沼气池中可以观察到原生动物，但其数量不大。迄今被描述过的原生动物有18种，包括鞭毛虫、纤毛虫和变形虫。鞭毛虫属于锥滴虫属（Tre pomonas）、四鞭毛虫属（Tetramitus）和Trigomonas属，变形虫属于Vahlkam pfia属和Hartmanella属，纤毛虫属于扭头属（Meto pus）、Trim yena属和Saprodinium属。

4.不产甲烷菌的数目

厌氧消化中的微生物种类和数量都非常多而复杂，其中以细菌为主。在代谢有机物分解最终形成甲烷的过程中，涉及最多和起重要作用的也是细菌类。20世纪50～60年代，许许多多的研究人员对厌氧消化中的细菌进行了计数（表1-8）。虽然这些计数的结果差异很大，其原因是计数的方法和条件不同，但可以说明厌氧消化的一些特性，如体系的微生物种类和数量都非常多而复杂。

（二）水解性细菌

水解性细菌（fermentative bacteria）的作用是将水不溶性的大分子有机聚合物分解为水溶性的较小分子有机物，进而能被产氢产乙酸菌利用，代谢为乙酸、二氧化碳和氢，提供产甲烷菌的底物，最后产生甲烷。水解性细菌主要有纤维素分解菌、半纤维素分解菌、淀粉分解菌、蛋白质分解菌、脂肪分解菌和核酸分解菌等。

1.纤维素分解菌（cellulose-splitting bacteria）

在沼气生产中，特别是农村沼气池中，常使用大量含纤维素的发酵原料。要把大量的纤维素分解成小分子化合物，必须有大量纤维素分解菌代谢产生纤维素酶来起作用。对于以纤维素为主的发酵原料来说，纤维素的分解是沼气发酵的第一步，也是重要的一步。纤维素的分解一般速率很慢，因此，纤维素分解的速率决定整个沼气发酵的速率和原料的利用率，也就是说纤维素分解速率对以后的发酵步骤起着制约速率的作用，此过程即称纤维素分解限速步骤。

许多研究结果显示，在沼气发酵中，产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenas）、奥氏梭菌（Clostridium omelianskii）、高温纤维梭菌（Clostridium thermocellum）、溶解梭菌（Clostridium dissolvens）等菌对纤维素有较强的分解能力。

2.半纤维素分解菌（semi-cellulose-splitting bacteria）

半纤维素分解菌使原料中的半纤维素分解成木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等。对于农村沼气发酵原料，半纤维素的数量仅次于纤维素，因此，半纤维素分解菌也是沼气发酵中重要的细菌。

相关的研究结果表明，在猪圈废物厌氧消化中，半纤维素分解菌与纤维素分解菌的数量相近。Show的研究发现，厌氧消化猪圈废物期间，原料半纤维素显著降解。我国河北微生物研究所的研究结果显示，在进料后的一个月，半纤维素的分解速度大于纤维素的分解速度。

3.淀粉分解菌（starch-splitting bacteria）

淀粉分解菌的作用是水解淀粉成葡萄糖。淀粉分解菌的数量在某些含淀粉较多的工业污水中是很大的。

淀粉分解菌主要是拟杆菌、革兰阴性球菌和丁酸菌。1979年，中国科学院成都生物研究所从下水污泥消化器中分离出了分解淀粉能力很强的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutzlicum），能将淀粉分解产生丙酮、丁醇、丁酸、乙酸和氢。

4.蛋白质分解菌（protein-splitting bacteria）

蛋白质分解菌起到水解蛋白质为氨基酸，并且进一步将氨基酸分解为有机酸、硫醇、氨和硫化氢等的作用。在一些沼气池中，蛋白质分解菌主要是革兰阳性细菌，其中梭菌占优势。

5.脂肪分解菌（fat-splitting bacteria）

把发酵原料中的脂肪分解成短链的脂肪酸，同时又将脂肪酸进一步分解成甲烷和二氧化碳。在含脂原料的沼气发酵中，脂肪分解菌的作用是相当重要的。弧菌是厌氧消化中占优势的脂肪分解菌，其它还有芽孢杆菌、产碱杆菌和假单胞菌。

二、沼气发酵的生物化学过程

沼气发酵过程是一个多菌群协同共生代谢的复杂过程，最终将含碳有机化合物彻底分解成甲烷和二氧化碳（图1-4）。从物质的转化角度来看，1962年R.E.Mckinney提出，沼气发酵可分为两个阶段；1976年O.W.Lawrence和P.L.McCarty将沼气发酵过程分为三个阶段；另外也有学者如W.W.Eckenfelder等1961年将沼气发酵过程分为四个阶段。

1.二阶段学说

沼气发酵的二阶段学说，即：①液化阶段（liquefaction），包括水解和酸化过程；②气化阶段（gasification），主要指甲烷化阶段。

2.三阶段学说

沼气发酵的三阶段学说包括如下3个阶段（图1-5）。

第一阶段（水解阶段）——发酵细菌产生胞外水解酶水解大分子有机聚合物，即纤维素、半纤维素、果胶、淀粉、脂类以及蛋白质等非水溶性含碳化合物，经水解性细菌产生的一系列水解酶将其水解成较小分子的水溶性化合物，如糖、醇、酸等。参与这一过程的微生物主要是发酵性细菌（fermentative bacteria），其种类和数量随有机物种类的不同而变化。通常按原料种类分为纤维素分解菌、脂肪分解菌、蛋白质分解菌等。

第二阶段（产酸阶段）——水解得到的各种水溶性产物进一步经微生物降解形成产甲烷细菌的底物，其产物主要是乙酸、氢和二氧化碳。参与这一过程的微生物种类主要是产氢产乙酸菌（the ob ligate H2-producing acetogenic bacteria）。

第三阶段（产甲烷阶段）——产甲烷细菌利用小分子物质转化生产甲烷和二氧化碳的过程。在这一阶段产甲烷细菌利用的基质范围相当窄，这类微生物只能利用甲酸、甲醇、甲胺、乙酸、乙醇、H2和CO2等。

3.四阶段学说

沼气发酵的四阶段学说包括如下4个阶段：第一阶段——水解阶段；第二阶段——酸化阶段；第三阶段——酸性衰退阶段；第四阶段——甲烷化阶段。

三、有机物产甲烷量的估计和计算

20世纪30年代，A.M.Buswell等通过一系列实验研究发现，各类有机物都可以经厌氧代谢而生成甲烷，它们完全降解后生成甲烷的数量和沼气成分由沼气发酵原料的化学组成所决定。Buswell和Neave把由脂肪酸厌氧分解为甲烷和二氧化碳的一般反应过程用下式表示，即：

当n为偶数时，发酵进行得最好。

后来，Buswell等给出了有机物厌氧代谢形成甲烷和二氧化碳的通式，该通式称为Buswell公式，即：

从Buswell公式可以推论：当n>时，水参与反应。

因此，只要知道了沼气发酵原料的化学组成，就可以通过这一公式计算沼气产量和组成，这一公式又称Buswell公式。

【例1-14】　计算葡萄糖的沼气产量和组成。

解：葡萄糖的分子式为C6H12O6，相对分子质量为180

则Buswell公式中的n=6，a=12，b=6，将其代入Buswell公式，得：

即：C6H12O6=3CO2+3CH4

180g葡萄糖可以生成3mol CO2和3molCH4

则1kg葡萄糖可生成×3=16.67（mol）CO2和CH4

在标准状态下（25℃，1atm），16.67mol气体的体积为

16.67×22.4=373（L）

答：每千克葡萄糖以沼气发酵后，可生成373L二氧化碳和373L甲烷，生成的沼气约0.75m3，甲烷含量为50％。

应用这一Buswell公式，我们便可计算脂肪、蛋白质和碳水化合物的沼气产量和甲烷含量，结果见表1-9。

从表中数据可以得知，碳水化合物和蛋白质发酵产沼气时，沼气中的甲烷含量仅为50％，而脂肪类原料发酵产沼气时，沼气中甲烷含量高达70％。大多数农村沼气发酵原料均是碳水化合物（粗纤维素和淀粉）含量较高，因此，农村沼气中的甲烷含量一般不会超过70％，通常在50％～60％之间。在利用含脂废水作沼气发酵原料时，沼气中的甲烷含量较高，接近70％。

利用Buswell公式可以推算理论产气率，即每去除1gCOD，可生成0.25g甲烷，相当于标准状态下0.35L甲烷，计算如下：

因此，1molCH4消耗2molO2或64g氧，在标准状态下1gCOD就相当于0.35L甲烷。当温度为35℃时，在1atm条件下，1gCOD就相当于0.395L甲烷。由于COD的测定较为方便，所以，这一理论产气量具有一定的现实意义。

【例1-15】　某酒厂每天排出COD含量为34500mg/L的废水500t，这500t废水若采用厌氧消化处理，理论上每天可产生甲烷多少立方米？

解：34500mg/L=34500g/m3=0.0345t/m3

500t废水以500m3计，则

每天排放的COD量=500m3×0.0345t/m3=17.25t

1gCOD产生0.35m3甲烷，即1tCOD可产生甲烷350m3

所以，每天产生的甲烷量=17.25t×350m3=6037.5m3

答：该酒厂每天的废水理论上可产生6037.5m3甲烷。

【例1-16】　厌氧反应器35℃时每天产沼气8000m3，其中甲烷含量为69％，计算每天降解COD的数量。

解：8000m3×69％×1000L/m3×1gCOD/0.395L CH4=14×106gCOD/d

答：每天降解COD的数量为14×106gCOD/d。

1964年，McCarty将Buswell公式进一步完善，提出：

式中　d=4n+a-2b-3c

s=COD用于合成部分的分数

e=COD转化为甲烷部分的分数

McCarty进一步建议进料可用下列经验式表示：

及：

有机物量TS（g）=12a+b+16c+14d+32f

　　　　　COD（g）=8（4a+b-2c-3d+5f）

有机氮或凯氏氮N=14d g

有机碳或TOC表示C=12a g

磷P=32f g

式中

式中，W表示有机物的量；D表示COD，g。

【例1-17】　由组分计算废物的COD值。

解：废物可表示为经验式CnHaObNc

C=200mg/L，H=25mg/L，O=100mg/L，N=40mg/L

摩尔浓度：

n=（200mg/L）/（12000mg/mol）=1.67×10-2mol/L

a=（25mg/L）/（1000mg/mol）=2.50×10-2mol/L

b=（100mg/L）/（16000mg/mol）=6.25×10-3mol/L

c=（40mg/L）/（14000mg/mol）=2.86×10-3mol/L

废物为1mol时，其经验式为：

四、有机质的厌氧消化过程

沼气发酵过程十分复杂，沼气发酵的开始必须是大分子有机聚合物的水解，这些大分子有机聚合物主要有碳水化合物（纤维素、淀粉等）类、蛋白质类、脂肪、核酸等。因此，沼气发酵的第一过程就是有机聚合物的分解，这一过程是在水解性细菌（或发酵性细菌）代谢中产生的各种水解酶将有机聚合物分解成较小的有机分子。其代谢反应如下：

纤维素水解→葡萄糖、单糖、二糖（纤维素分解菌，纤维素酶）

淀粉水解→葡萄糖、单糖、二糖（淀粉分解菌，液化型淀粉酶和糖化型淀粉酶）

脂肪水解→脂肪酸、甘油（脂肪分解菌，脂肪酶）

蛋白质水解→肽、氨基酸（蛋白质分解菌，酸性、中性和碱性蛋白酶）

当基质中的有机聚合物水解后，产氢产乙酸菌则利用葡萄糖、各种有机酸、醇、氨基酸和肽等代谢产生乙酸、氢、二氧化碳等小分子产物。其后，产甲烷细菌利用这些简单的有机物代谢产生甲烷（图1-6）。事实上，产氢产乙酸菌和产甲烷菌的代谢是密切相关的，这两类菌的相互作用才使有机物的甲烷矿化作用得以实现。

（一）碳水化合物的代谢

通常把除粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分以外的有机物统称为碳水化合物，它包括纤维素、淀粉、糖类、半纤维素、木质素、果胶质、聚戊糖、酸类、植物碱、树脂质、黏质物和色素等。除粗纤维（包括纤维素、半纤维素和木质素）外的碳水化合物统称为可溶性无氮物。

1.纤维素的分解代谢

微生物降解纤维素有三种理论：协同理论、原初反应假说和碎片理论（或短纤维形成理论）。

（1）协同理论　通常认为，真菌纤维素酶系降解纤维素被认为是所谓的内切葡聚糖酶（endo glucanase，EG）、外切纤维素酶（cello bio hdrolases，CBH）和β-葡聚糖苷酶（β-lucanases，ygGE）协同作用的结果。酶对纤维素的降解发生于内外切酶之间，即内切酶首先切割纤维素链使其暴露出末端，然后外切酶连续切割纤维二糖单位，而β-葡聚糖苷酶通过水解纤维二糖或纤维糊精解出纤维素酶反应抑制，完成协同反应。

协同机理目前较为普遍接受的纤维素降解机理，其过程可描述为：

（2）原初反应假说　原初反应假说是在研究褐腐菌降解纤维素的过程中发现的。褐腐菌菌丝主要生长在靠近次生木质细胞壁的S3层上，并产生扩散进S2层的降解剂，引起扩散性腐烂，在褐腐菌降解下结晶纤维素的机械强度大幅度降低，但只有极微量的质量损失和很少的还原糖生成。这与纤维素酶降解时的聚合度降低而还原糖增加现象明显不同，因此，便出现了结晶纤维素降解的多步骤学说。该学说认为，原初反应即无序化反应使纤维素的结晶状态发生改变，而更便于随后的纤维素水解。

由于天然纤维素是一种水不溶性的底物，因此，与大多数能转化可溶性底物为产物的酶不同，纤维素酶必须在接触和催化发生之前扩散到纤维素的微纤维表面才能起催化作用。在研究纤维素降解的原初反应机理时才发现，由于纤维素酶分子太大，以至于不能进入纤维素内，因而，认为其降解只能与小分子非酶试剂有关。H2O2-Fe2+系统与结晶纤维素反应能够模拟出褐腐菌早期阶段的降解过程，它能催化广泛的纤维素解聚并使其碱溶性迅速增加失重，且残余纤维素比未处理底物对纤维素酶反应更敏感。

（3）碎片理论　很早人们就发现纤维素降解过程中有短纤维形成，但是否是纤维素降解中第一步所必需的，一直处于争论中。在对该过程机理研究时发现，短纤维的形成与两种酶有关，即内切葡聚糖酶和一种与其相关的稳定活性成分，该组分似乎与内外切酶无关，单独不能起液化作用。但短纤维形成是否是必需的原初步骤，或是说使纤维素材料更易于液化仍然是一个谜。

沼气发酵原料中大部分是纤维素和半纤维素，它们在农作物秸秆和牲畜粪便中含量十分丰富。它们可厌氧分解成葡萄糖、纤维二糖、木糖、木二糖，这些大部分是不产甲烷菌的主要能源来源。马基（Maki）很早指出，纤维素分解的快慢直接影响到沼气发酵的速率。Kotze等（1968）则进一步指出复杂有机物分子与酶活性表面接触机会的多少是限制速率的。实际上这是指纤维素的液化阶段，液化速率的快慢必然影响后两个阶段的速率。纤维素的厌氧分解过程是产生可燃气体的基本途径之一，也是自然界碳素循环中最重要的环节之一。

纤维素是作物秸秆的主要成分，它是由吡喃葡萄糖单位以β1-4葡萄糖苷键连接的（纤维二糖单位）高度聚合的葡萄糖的线型分子（图1-7），植物原始结构中的纤维素分子含有1400～10000个葡萄糖基。1948年Pigman和Goepp用黏度法测定了这些纤维素分子的相对分子质量为20万～30万，用超速离心法测定则大于100万。这些线状分子以很多个键牢固地连接成束，这些束叫做微胶粒。它们又以一定的方式构成定向网状结构。此外，纤维素可被蜡质包围，或与半纤维素、木质素、果胶质或其它多糖相连接，这样使得天然纤维素抵抗微生物的侵蚀。

通常烹调蔬菜的方法可以使纤维素变得容易降解，但人对它的消化能力很低。牛、马和羊等食草动物的饲料一般不预先处理，只有易降解的纤维素才被消化，剩下的是更为木质化的和难降解的纤维残渣随粪便排出，成为沼气发酵原料。蔬菜等加工厂的废物，其厌氧消化的难易取决于处理过程中天然纤维素的降解程度。经过机械加工和碱处理的纤维素（如纸）就很容易降解，这种处理有助于破坏包围纤维素的木质素、半纤维素和蜡质，为微生物侵蚀创造有利条件。

不同的纤维素具有很不同的生化消化度。能水解纤维素的酶也不止一种，有的广泛分布于分解纤维素的细菌和霉菌中，另一些则并不常见。对于厌氧纤维素降解的研究已进行了近八十年。早在1902年奥梅良斯基就从沟泥的富集培养物中分离了两种厌氧降解纤维素的产孢菌。他还作了厌氧降解纤维素的实验，实验表明纤维二糖和葡萄糖是由纤维素形成甲烷的中间产物。从大量纤维素厌氧分解形成甲烷的事实可以推断：富含纤维原料的沼气池内必定有纤维素酶存在，它们使纤维素降解成糖。

相关的研究表明，纤维素为唯一碳源的甲烷发酵是有节奏地进行的。产气高峰在三段时间出现，第二段产气最高。在第一段，中间体丙酸积累较多，第二段和第三段积累相当数量的醋酸（表1-10），然而丁酸浓度始终在（30～50）×10-6。

①加入四氯化碳以抑制甲烷发酵，使中间产物积累。

从三个阶段产气最高时的碳源营养类型的情况看（表1-11）丁酸浓度虽维持在最低水平，但是利用丁酸盐的微生物却在大幅度增长。乙酸是主要的中间体，其浓度增长而利用乙酸盐的微生物增加上千倍。利用丙酸盐的微生物变化不大。这就显示了纤维素经丁酸、乙酸生成甲烷的途径在活跃地进行。通常在纤维素原料的沼气发酵中，乙酸也是主要的中间体，而丁酸浓度很低，但在发酵受抑制时，丁酸含量会显著增加，这与上述情况相似。在类似的厌氧生态环境——瘤胃的研究中，早就证实了纤维素丁酸发酵。因此，纤维素厌氧降解形成甲烷，主要可能经由纤维素→葡萄糖→丁酸→乙酸→甲烷的途径，反应如下：

C6H12O6→CH3CH2CH2COOH+2CO2+2H2

2CH3CH2CH2COOH+2H2O+CO2→4CH3COOH+CH4

4CH3COOH→4CH4+4CO2

CO2+4H2→CH4+2H2O

总反应式C6H12O6→3CH4+3CO2

另外从不同投料的厌氧消化器中分离的纤维素分解菌，经纯培养研究（Hungate，1950；Maki，1954），可分为两群：一群主要从纤维素产生氢、二氧化碳、乙醇和乙酸；另一群主要从纤维素产生乙酸、丙酸和二氧化碳，没有测出氢。而一般纤维素的沼气发酵中丙酸浓度仅次于乙酸。因此，可以把纤维素形成甲烷的途径大致归为：

2.糖类的分解代谢

以上讨论了纤维素厌氧分解的途径，这里将进一步讨论糖类的厌氧分解代谢。包括纤维素在内的碳水化合物，必须以单糖或双糖的形式才能透过微生物胞壁。多糖物质水解时，微生物很容易把它的水解产物转化成葡萄糖，而葡萄糖又继续降解。近期糖类的厌氧代谢研究得比较多（McCarty等，1962；Hattingh等，1967；Kotze，1967；Kotze等，1968；Thiel等，1968）。

葡萄糖厌氧降解成丙酮酸的三个主要反应，即糖解途径（EMP途径）、磷酸戊糖路线和2-酮、3-脱氧、6-P-葡萄糖酸盐路线（图1-8）。McCarty等（1962）利用14C示踪物对含有糖基质的消化器进行了研究，认为EMP途径和磷酸戊糖循环（一磷酸己糖分路）都可能出现（图1-9）。哈廷等（Hattingh，1967）在沼气发酵中发现糖解中正常的限制速度酶6-磷酸果糖激酶，它的活力随产气的增加成正比例地增强。考曾等（Kotze，1968）对几个实验室和大型消化器内中间代谢的酶活力作了比较研究，指出存在酶的模式的差异。所有消化器内都有糖解和乙醛酸途径的酶，但是活跃的一磷酸己糖分路（测得6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活动）只在含有综合基质的消化器中才有。在分别装有综合基质和原始下水道污物的消化器内，苹果酸脱氢酶（MDH）的高度活力表明：存在着活跃的三羧酸循环（TCA），或是部分的三羧酸循环。辛普森（Simposon，1960）曾指出草醋酸的代谢在厌氧系统中（如厌氧消化器中）不能进行。但是消化器内存在谷氨酸-草醋酸转氨酶的活力强度说明草醋酸活跃地参与氨基酸代谢。MDH的活力可能表明厌氧消化中草醋酸盐至少参与TCA循环的一部分。而苹果酸酶（ME）的存在，可以催化下列反应：

Hungate从厌氧消化污泥中分离了一株菌，它在纤维素、酵母膏、磷酸盐培养基上充氮培养，可以形成琥珀酸。西尔（Thiel，1968）在使厌氧消化失败的情况下研究了三个相似的实验室消化器内的生物和化学的变化，所测定的大多数酶的活性是显著相关的。这些酶（包括糖解的酶）决定了一磷酸己糖分路、TCA循环和氨基酸的新陈代谢。这些研究表明，在厌氧消化器中存在EMP途径、一磷酸己糖分路和TCA循环的一部分。

EMP途径是厌氧和好氧葡萄糖代谢的共同途径，也是葡萄糖厌氧降解的主要途径。这样酵解一个葡萄糖分子可得到两个ATP分子。经由一磷酸己糖分路，葡萄糖也降解成丙酮酸。丙酮酸在碳水化合物、脂类和蛋白质的代谢中起连接作用，丙酮酸进一步代谢有4条途径，即：①还原生成乳酸；②脱羧形成二碳中间体，随后形成乙酸、乙酰乙酸、乙醇、丁醇及丙醇或丙酮等；③脱羧形成乙醛，再转变为乙醇；④产生乙酸和甲酸。

3.半纤维素和果胶的厌氧代谢

半纤维素在沼气发酵原料中的数量低于纤维素。它包括许多高分子的多缩戊糖，比纤维素容易水解，水解后形成木糖、阿拉伯糖及少量的甘露糖、半乳糖等。它含有多糖醛酸，所以水解时也产生糖醛酸，如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸。这种糖醛酸的残基以甲酯态含于半纤维素的分子中，其甲氧基可能在降解中形成甲醇。沼气发酵能有效地消化半纤维素。已有人从厌氧消化的猪圈废弃物中分离到数量上与纤维素分解菌相近的半纤维素分解菌。半纤维素水解的戊糖和少数己糖可以进入类似前述糖类分解的途径，通常沼气发酵液中含有相当数量的丙酸就是存在该途径的证据。

果胶亦为多缩戊糖，在沼气发酵原料中含量很少，水解后可得半乳糖、树胶糖、木糖、半乳糖醛酸、甲醇及醋酸等，而主要为半乳糖醛酸及甲醇。

在沼气池中半纤维素和果胶易受微生物侵袭，它们都比纤维素容易水解，有些纤维素分解菌同样能降解它们。在烹调蔬菜时，也能除去大部分这类聚合物。它们的代谢途径可能相同。

4.木质素及其衍生物的分解代谢

木质素是一种无定形的环状化合物的聚合物，很难降解，其化学成分及结构尚未确定。造纸工业中常用碱除去木质素。一般认为它在厌氧消化中难降解或只能部分降解，但已有人提出，沼气液渣中富含的腐殖酸可能是由木质素形成的，它们都是环状化合物的聚合物。腐殖酸能刺激作物生长并作为营养。木质素在植物原始结构中往往填充在纤维束之间，它可以阻碍纤维素的厌氧消化。

对于木质素的衍生物芳香环化合物的厌氧消化研究得多一些。费里等（Ferry，1976）研究了以苯甲酸为唯一有机碳源和能源的沼气发酵富集培养物，发现在苯甲酸盐的还原异化作用中（不产甲烷阶段），先破坏形成乙酸盐、甲酸盐、H2和CO2。这一反应涉及一种未知菌，随后这些中间产物被转化成甲烷和二氧化碳（产甲烷阶段）。

海利（Healy，1979）研究了十一种芳香环化合物的厌氧生物降解成甲烷。所用的芳香化合物是香草醛、香草酸、阿魏酸、肉桂酸、苯甲酸、儿茶酸、原儿茶酚、对羧基苯甲酸、丁香酸和丁香醛。研究表明适应其中某一芳香环化合物的衍生物区系也能适应以上选择的其它芳香物质。而且，这些芳香化合物中的有机碳，一半以上可能转化成甲烷。由此可见简单芳香环化合物经沼气发酵形成甲烷的过程也许在自然生境中普遍地发生。

（二）类脂化合物的代谢

类脂化合物包括脂肪、磷脂、游离脂肪酸、蜡类、油类等，它们在沼气发酵原料中含量很低。有人测定猪圈废弃物中（猪粪尿和残剩的猪食等）只含百分之几类脂化合物，但很容易厌氧消化形成甲烷。类脂化合物水解的主要产物是脂肪酸和甘油（图1-10）。甘油先转化成磷酸甘油醛，再形成丙酮酸，然后进入丙酮酸的代谢途径，奇诺韦斯与马哈测定了脂肪酸的厌氧消化，结果表明醋酸是脂肪酸的主要降解产物。而Heukelekian和Mueller测定了一批污泥消化中的硬脂酸、棕榈酸和肉豆蔻酸的浓度变化，发现由硬脂酸变成棕榈酸（减少两个碳）再变成肉豆蔻酸（又减少两个碳）的显著变化。因此他们提出了在脂肪酸的厌氧降解中，有与Knoopβ-氧化学说相似的过程发生，即脂肪酸β-氧化降解（图1-11）。姆卡蒂等（McCarty等，1962）应用辛酸和棕榈酸的14C示踪物，也显示了直链脂肪酸经β-氧化的降解过程。这样直链脂肪酸能逐级降解，最终形成1-，2-，或3-碳脂肪酸。显然2-碳的乙酸是脂肪酸β-氧化的主要产物，它可能是乙酰辅酶A。而产生的氢是形成甲烷的重要原料，它可以先形成NADH2和NADPH2，再用于还原CO2成甲烷。用Knoop氏β-氧化学说阐明脂肪酸降解的过程是令人满意的，但是至今还没有已知的厌氧细菌能引起这些反应，这可能是一种共生反应。此外，奇诺韦斯（Chynoweth）和罗伯特·马（RobertMah）还发现，用氯仿抑制甲烷形成时，棕榈酸的降解仍能继续进行。这表明若没有二氧化碳还原成甲烷，电子接受系统必定还能起作用，实际上形成的丁酸增加了。后者可能是降解获得的乙酸加氢形成的，反应如下：

（三）含氮化合物的代谢

这里说的含氮化合物主要是蛋白质类化合物，它在沼气发酵原料中占一定比例（一般含量不高），在沼气发酵液中已测得了蛋白质分解酶，并分离出了分解和脱氨的细菌。因此在沼气池中，蛋白质似乎可以像在瘤胃的厌氧环境中一样，按以下途径降解：蛋白质水解成多肽与氨基酸，其中一部分氨基酸可按存在的微生物在厌氧条件下经几条路径进行水解脱氨，形成硫醇、胺、苯酚、硫化氢及氨（图1-12）。此外氨基酸分解获得的有机酸、醇等其它物质，可以经前述类似的途径产生甲烷和二氧化碳。沼气发酵液中发现的小量支链有机酸主要来自于氨基酸脱氨，而不是由于碳水化合物的发酵。各种氨基酸不是都按同一方式降解，下面列举几个熟知的反应。

甘氨酸脱氨形成醋酸

CH2NH2COOH+2H→CH3COOH+NH3

丙氨酸经氧化脱去氨基形成醋酸

CH3CHNH2COOH+2H2O→CH3COOH+NH3+4H+CO2

丝氨酸能按下列反应分解

HOCH2CHNH2COOH→CH3COCOOH+NH3

半胱氨酸的降解反应

4C3H7O2NS+8H2O→4CH3COOH+4CO2+4NH3+4H2S+8H

4CH3COOH+8H→5CH4+3CO2+2H2O

总反应式：

4C3H7O3NS+6H2O→5CH4+7CO2+4NH3+4H2S

氨基酸反应所得的终产物都很类似于碳水化合物和脂肪液化的终产物，都可进一步形成甲烷和二氧化碳。另外，多肽、氨基酸和氨还可以重新转变成蛋白质，因此沼气池中的蛋白质类物质的纯损失并不很大。若脱氨作用太激烈，沼气发酵液中氨浓度也会不断升高。实际上正常运转的沼气池不会出现氨浓度不断上升，而仅在一定范围内波动，沼气中含氨量也极微。这表明正常的沼气发酵中，蛋白质类物质不会比碳水化合物、脂肪更多地用于形成甲烷。

非蛋白质类含氮化合物在沼气发酵中也能降解和代谢。瘤胃的研究表明了许多厌氧细菌可以降解嘌呤和嘧啶，发酵形成氢、二氧化碳、氨、丙酸、乙酸、甲酸和乳酸等。在沼气发酵中也证明了这些含氮化合物的降解。嘌呤和嘧啶显然也可以用于合成菌体的核酸。还有硝酸盐和亚硝酸盐可被还原成氨。硝酸盐又可成为沼气发酵微生物的氮源。Gasser和Jeris在实验室的沼气发酵中还发现，在一定条件下大部分硝酸态氮可以形成氮气释放出来，这表明可能有一些沼气发酵微生物借助于硝酸盐的呼吸作用，除去碳水化合物发酵所产生的电子（氢）。

碳水化合物、脂类和蛋白质的厌氧消化代谢可用图1-13表示。