实验四　泡菜中乳酸菌的分离及初步鉴定

一、实验目的

（1）了解乳酸菌的菌落特征及细胞形态。

（2）掌握乳酸菌的分离及鉴定原理。

二、实验原理

在人体肠道内栖息着数百种细菌，其数量超过百万亿个。其中对人体健康有益的叫益生菌，以双歧杆菌、屎肠球菌等为代表，对人体健康有害的叫有害菌，以大肠杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌等为代表。益生菌是一个庞大的菌群，有害菌也是一个不小的菌群，当益生菌占优势时（占总数的80%以上），人体则保持健康状态，否则处于亚健康或非健康状态。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。

乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。根据其利用葡萄糖后的产物不同，分为同型发酵群和异型发酵群。多数种可发酵乳糖，而不利用乳酸，发酵后可将pH下降至6.0以下。乳酸菌大体上可分为两大类。一类是动物源乳酸菌，另一类是植物源乳酸菌。因为动物源乳酸菌取自动物，因菌种常处于相对不稳定状态，其生物功效也较不稳定，且在大量食用时，很容易导致人体动物蛋白过敏，即排斥反应。而植物源乳酸菌，因为取自植物易被人体认可，不论摄取多大的量，人体不会产生异体蛋白排斥反应，且植物源乳酸菌比动物源乳酸菌更具有活力，能比动物源多8倍的数量到达人体小肠内定殖，从而发挥其强大而稳定的生物功效。

乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。可以说，如果乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌是一种存在于人类体内的重要益生菌之一，有助人体肠脏的健康，常被视为健康食品而被广泛用于轻工业、医药及饲料工业等许多行业上。

乳酸菌发酵食品作为营养保健食品已广泛被国内外消费者所接受，中国民间已具有较悠久的加工和食用历史。在中国一些地区更蕴藏着丰富、优良的民间发酵食品，泡菜便是其中的一类。从传统自然发酵的泡菜中分离筛选具有良好发酵蔬菜或发酵乳特性的乳酸菌菌株，通过菌株产香、产黏、产酸等特性的研究，为生产乳酸菌纯菌发酵剂、改进传统乳酸发酵食品生产工艺等，提供有益技术支撑与方法参考，为进一步研究制定相关传统食品工业化、标准化生产工艺提供直接证据。

本实验采用溴甲酚绿牛乳营养琼脂平板分离乳酸菌。溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中呈蓝色。在分离培养基（pH6.8）中加处溴甲酚绿指示剂后呈蓝绿色，乳酸菌在该培养基中生长并分解乳糖，产生乳酸，使菌落呈黄色，菌落周围的培养基也变为黄色。

三、实验材料

（1）样品：含乳酸菌的泡菜。

（2）培养基：BCG牛乳培养基。

（3）试剂：结晶紫，乙醇，草酸氨，碘，碘化钾，番红，NaOH，NaCl等。

（4）仪器与设备：高压蒸汽灭菌锅，电磁炉，烧杯，量筒，培养皿。

四、实验步骤

1.菌悬液的配制

取1只洁净三角瓶，盛以225mL生理盐水；7支洁净试管，各盛9mL的生理盐水；加塞包扎后在103kPa 121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，得到无菌生理盐水。将泡菜样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25mL，加入盛有225mL无菌生理盐水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，使样品均匀分散，即为10-1倍的样品稀释液；将7支装9mL生理盐水的无菌试管，依次标记“10-2”、“10-3”、“10-4”、“10-5”、“10-6”、“10-7”，再用无菌移液管吸10-1倍的菌悬液1mL放入依次装有9mL无菌水的试管中，稀释混匀便得到10-2倍稀释液，如此重复依次制得10-3～10-7倍的稀释液。

2.倒平板

取无菌平板12个，编号标明“10-1”、“10-5”、“10-6”、“10-7”各三套；将经高温消毒的培养基冷却至50℃左右，按无菌操作原则倒12个平板，每皿约15mL；平置使培养基均匀分布在皿底，凝固待用。

3.乳酸菌分离

①平板划线法：接种环挑取10-1倍菌液，按无菌操作对标有“10-1”的3个平板进行划线操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培养48h。

②平板涂布法：用三支1mL无菌移液管分别吸取10-5倍、10-6倍和10-7倍的稀释菌悬液各1mL，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.1mL；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上均匀涂布，平放于实验台上20min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48h。

4. 菌落观察

恒温培养48h后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，为1～3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。

5.乳酸菌初步鉴定

取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片；结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染，干燥后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中保加利亚乳杆菌呈杆状（单杆、双杆或长丝状）；嗜热链球菌，呈球状（成对、短链或长链状）。

五、结果与讨论

（1）记录从泡菜中分离纯化得到的乳酸菌种类、数量（菌落数），并绘出乳酸菌形态。

（2）根据实验结果，推断乳酸菌有什么特点？从泡菜中分离的乳酸菌如何进行初步鉴别？

（3）泡菜中含有一定乳酸菌，乳酸菌对人类有哪些作用，试预测乳酸菌食品的发展前景。