第三节　分离与精制方法

天然药物经溶剂提取、回收溶剂得到粗提取物，有效成分在粗提取物中的含量还很低。要获得有效成分含量高的提取物或纯的化合物，尚需进一步除去杂质，进行分离、纯化（精制）。具体采用的分离方法则根据化学成分的物理和化学性质等不同而各异，以后各章将通过实例加以叙述，本节仅简要介绍天然药物化学研究中常用的分离方法。

一、溶剂分离法

根据物质“相似相溶”的溶解特性，采用适当的溶剂将所需要的有效成分从提取物中溶解出来或去除不需要的杂质，这种方法即为溶剂分离法。它包括根据化合物的溶解度差别进行分离和根据化合物的酸碱性进行分离两种。

1.根据化合物的溶解度差别进行分离

（1）有机溶剂分步提取法

利用化学成分在不同极性溶剂中的溶解度不同进行分离，一般选用3～4种极性由低到高的溶剂进行分步分离提取，得到相应的提取部位。如果天然药物的水提取浸膏或乙醇提取浸膏不容易均匀分散，可拌入适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后在搅拌下低温或自然干燥。再选择不同溶剂依次提取，使总提取物中各种化学成分按照在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离（图2-10）。

（2）析出沉淀法

析出沉淀法系向天然药物提取溶液（水或乙醇溶液）中加入另一种溶剂，析出某种（某类）成分，或析出其杂质。如提取黄酮苷类成分时可以向乙醇溶液中加入乙醚，冷却放置可得总黄酮苷的沉淀（图2-11），这种方法也可以用于分离纯化总皂苷。除去天然药物水提液中的树胶、黏液质、蛋白质、糊化淀粉等时，可以加入数倍量的乙醇（通常使提取液中乙醇含量达到80%），使这些不溶于乙醇的成分自溶液中以沉淀形式析出；也可以在浓缩的乙醇提液中加入水，放置沉淀以除去树脂、叶绿素等脂溶性杂质。例如自白及水提取液中获得白及胶，可采用加乙醇沉淀法；自新鲜栝楼根汁中制取天花粉素，可滴入丙酮使之分次沉淀析出。目前，提取多糖及多肽类化合物，多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析出的办法。

2.根据化合物的酸碱性进行分离

（1）酸水法

酸性、碱性或两性有机化合物可以通过加入酸或碱调节pH，改变分子的存在状态（游离型或离解型），从而改变溶解度，使某种成分析出。例如生物碱一般不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱，因此可以通过酸提碱沉法来分离纯化生物碱（图2-12）；而提取分离黄酮、蒽醌、酚酸等成分时也可以采用碱提酸沉法（具体见各论部分）。

（2）试剂沉淀法

试剂沉淀法是指在天然药物的水提取物中加入试剂使酸性或碱性化合物生成水不溶解的盐类从而析出的一种方法。酸性化合物可以做成钙盐、钡盐、铅盐沉淀，生物碱可做成苦味酸盐、有机酸盐、磷钼酸盐、硅钨酸盐、雷氏铵盐等。

（3）pH梯度法

当天然药物含有酸碱性强弱不同的化合物时，可采用pH梯度法进行分离，如在生物碱的分离中可以在不同pH下用不溶于水的有机溶剂分步萃取得到不同种类的生物碱。

二、两相溶剂萃取法

1.萃取法的原理

萃取法是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高，分离效果就越好。如果水提取液中有效成分是亲脂性物质，一般多用亲脂性有机溶剂如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；如果有效成分是偏亲水性物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，如乙酸乙酯、正丁醇等与水相之间进行两相萃取，还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。分离黄酮类成分时，多采用乙酸乙酯和水两相萃取体系；分离亲水性强的皂苷时则多选用正丁醇、异戊醇和水两相萃取体系。不过，一般有机溶剂的亲水性越大，与水做两相萃取的效果就越不好，这是因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。

两相溶剂萃取操作需注意以下几点。

（1）稀浸膏的相对密度

萃取使用的稀浸膏的相对密度最好在1.1～1.2之间，过稀则溶剂用量太大，产生成分交叉，同时影响操作；过浓则分散不均匀，不容易分层。

（2）萃取溶剂的用量

萃取溶剂与稀浸膏应保持一定量的比例，第一次的萃取溶剂要多一些，一般为水提取液的1/3，不超过水提取液的1/2，以后的用量可以适当减少，一般在1/4～1/6之间。

（3）萃取次数

一般萃取3～4次即可。但当亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时，需增加萃取次数，或改变萃取溶剂。

（4）乳化

萃取时有些溶剂容易乳化，如乙酸乙酯、氯仿等。如果发生乳化现象，可利用如下方法进行破乳：①搅动乳化层并延长分层放置时间；②增加萃取溶剂的量；③抽滤乳化层；④将乳化层稍稍加热破乳。

（5）萃取设备

小量（实验室）萃取，可在分液漏斗中进行；如为中量萃取，可在较大的适当的下口瓶中进行。在工业生产中大量萃取多在密闭萃取罐内进行，在浸膏中加入萃取溶剂后用搅拌机搅拌2～5min，使稀浸膏和萃取溶剂充分混合，再放置令其分层。有时将两相溶液喷雾混合，以增大接触面积，提高萃取效率，也可采用两相溶剂逆流连续萃取装置。

2.连续萃取法

为克服使用分液漏斗多次萃取的操作麻烦，Kutcher和Steude于1903年发明了连续萃取器，利用两种溶剂的相对密度不同自然分层或分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质的原理。选择连续萃取法时，需视所用溶剂的相对密度大小以及被提取的水溶液相对密度的情况而采用不同式样的仪器。溶剂在进行萃取后，可自动流入加热器中，蒸发成为气体，遇冷凝器复变成液体，再进行萃取，如此循环不已。此法简便且可避免乳化，由于两相呈动态逆流相遇，并经常能保持较大的浓度差，萃取过程能连续不断地进行，所以溶剂用量不多而萃取效率甚高。

逆流连续萃取法不需要加热，装置由一根、数根或更多的萃取管组成，管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。例如用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯仿盛于萃取管内，而相对密度小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内，开启活塞，则水浸液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大，萃取就比较完全。如果需要用相对密度小的溶剂如乙酸乙酯进行萃取，则要将水提浓缩液装在萃取管内，乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取时可取样品用薄层色谱、纸色谱及显色反应或沉淀反应检查萃取是否完全。

3.逆流分配法

逆流分配（counter current distribution，CCD）法，又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，是一种多次、连续的液液萃取分离过程。如图2-13（a）所示，在多个分液漏斗中装入固定相，在No.0漏斗中溶入溶质并加入流动相溶剂，振摇使两相溶剂充分混合。静置分层后，分出流动相，令其移入No.1管，再在No.0管中补加新鲜流动相。再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去，溶质即在两相溶剂相对做逆流移动过程中，不断地重新分配并达到分离的目的。进行多次转移时，使用分液漏斗十分不便，而须采用Craig逆流分溶仪，该仪器为由上百个萃取单元组成的全自动连续液液萃取装置。每个单元相当于一个分液漏斗[图2-13（b）]。图2-14为逆流分溶仪每个萃取单元所进行的振摇萃取（a）、静置分层（b）、两相分开（c）、转移（d）几个操作程序的连接过程。

CCD法因为操作条件温和、试样容易回收，故特别适合中等极性、不稳定物质的分离。另外，溶质浓度越低，分离效果越好。但是，试样极性过大或过小，以及分配系数受浓度或温度影响过大时则不宜采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。但该法操作时间长，萃取管易因机械振荡而损坏，消耗溶剂亦多，在应用上常受到一定限制。

三、结晶法

结晶法的分离原理是利用温度引起溶解度的改变以分离物质。结晶法及重结晶是工业化制备单体化合物的最常用的方法之一，其操作相对简单，需要的仪器设备简单。结晶法适用于产品与杂质溶解度差别较大的体系，如果待分离的成分有一定的结晶形态，通过寻找合适的溶剂溶解，待放冷或稍浓缩便可得到结晶，从而达到分离精制的目的。此外，在某些复杂的天然产物的结构确证中，单晶X-射线衍射技术在结构解析及立体构型确定中具有重要作用。通常结晶或重结晶后可以得到单体化合物，但有时候得到的结晶可能会是混合物。对于某些不易结晶的化合物则需要制备结晶性的衍生物或盐进行纯化，如需要可再用化学方法处理得到原化合物。例如粉末状莲心碱是通过氯酸盐结晶而纯化的。

在结晶操作过程中，应该注意以下几个方面。

1.溶剂的选择

合适的溶剂是形成结晶的关键。首先选择的溶剂应该不能和目标成分发生化学反应，同时溶解度可以随温度的不同而有显著的变化，即在温度低时对所需要的成分溶解度较小，温度高时溶解度较大。对杂质来说，所选择的溶剂应该是冷热均不溶解（过滤除去）或冷热均溶解（结晶后留在母液）。常用的结晶溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等。此外，所选结晶溶剂的沸点要低于化合物的熔点，以免化合物受热分解。在工业化生产中一般首先选择使用乙醇作结晶溶剂，因为它是一个有脂溶性和水溶性基团的溶剂，而且比较经济安全。

如果使用一种溶剂得不到结晶时，可以选择用两种或两种以上的混合溶剂。混合溶剂的选择要求是：低沸点的溶剂对待分离成分的溶解度大，而高沸点的溶剂对待分离成分的溶解度小。一般操作方法是：先将需要结晶的样品溶于易溶的溶剂中，在加热的情况下滴加难溶的溶剂直到混浊，再加热溶解或稍滴加易溶的溶剂使全溶后放置析晶。也可以直接使用配好的小量各种比例的混合溶剂，进行预试验，筛选合适的混合溶剂及比例。此外，有些化合物只能在特定溶剂中形成结晶，例如葛根素、逆没食子酸（ellagic acid）在冰醋酸中易形成结晶，大黄素（emodin）在吡啶中易于结晶；萱草毒素（hemerocallin）在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中易得到结晶；而穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物在丙酮-水中较易得到结晶。

2.结晶溶液的除杂

如果结晶溶液中含有过多的色素等杂质会影响结晶的效果或最终结晶产物的外观，因此结晶前就需要对结晶溶液进行除杂后再结晶。常用的除杂方法有：过滤除去不溶性杂质颗粒；加入少量活性炭脱色（除去叶绿素及水溶性色素）；结晶溶液通过氧化铝、硅胶或硅藻土装填的短玻璃柱除杂。而使用吸附剂纯化结晶溶液时，其吸附杂质的同时会对目标成分产生吸附作用，需谨慎使用。

3.结晶溶液的制备

一般用适量的溶剂在加温的情况下溶解化合物（或样品）获得结晶溶液，结晶溶液通常是过饱和溶液，溶液通过放置可得到晶体。如果在室温中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶过快析出更多的杂质；结晶溶液浓度越高，降温越快，析出结晶的速度也就越快，但得到结晶颗粒较小，杂质较多；结晶溶液太浓，黏度大反而不易结晶化。所以，适宜的结晶溶液浓度才有可能得到晶形较大而纯度较高的结晶。有的化合物其结晶的形成需要较长的时间，如铃兰毒苷等，有时需放置数天或更长的时间。

4.加速结晶的方法

制备结晶时如果放置一段时间后没有结晶析出，可以考虑加入极微量的晶种（引入晶种）。加晶种是诱导晶核形成常用而有效的手段。结晶过程是有高度选择性的，当加入同种分子或离子，结晶多会立即长大。而溶液中如果是光学异构体的混合物，还可依晶种性质优先析出其同种光学异构体。没有晶种时，可用玻璃棒蘸过饱和溶液一滴，在空气中任溶剂挥散，再用以摩擦容器内壁溶液边缘处，以诱导结晶的形成。

5.重结晶及分步结晶

通常初步析出的结晶总会带有一些杂质，可以用溶剂溶解再次结晶精制，这种方法称为重结晶法。结晶过程中所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶，这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。晶态物质在分步结晶过程中，结晶的析出总是越来越快，纯度也越来越高。分步结晶法各步所得结晶，其纯度往往有较大的差异，在未检测前不可贸然合并以免纯度下降。

6.结晶纯度的判定

（1）通过结晶的熔点判断

化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔距，可以作为纯度鉴定的初步依据，这是非结晶物质所没有的物理性质。化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异，如原托品碱在氯仿中形成棱柱状结晶，熔点为207℃；在丙酮中则形成半球状结晶，熔点为203℃；在氯仿和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。所以文献中常在化合物的晶形、熔点之后注明所用溶剂。一般单体纯化合物结晶的熔距较窄，有时要求在0.5℃左右，如果熔距较长则表示化合物不纯。有时化合物熔点一致，熔距较窄，也不是单体，如一些立体异构体和结构非常类似的混合物。还有些化合物具有双熔点的特性，即在某一温度已经全部融熔，当温度继续上升时又固化，再升温至一定温度又熔化或分解，如防己诺林碱在176℃时熔化，至200℃时又固化，再在242℃时分解。

（2）通过色谱方法确定纯度

一般结晶溶解后采用薄层色谱或纸色谱法经数种不同展开剂系统分析，均为一个斑点则可认为是一个单体化合物。有些化合物在一般色谱条件下，虽然呈现一个斑点，但并不一定是单体成分。例如鹿含草中主成分高熊果苷、异高熊果苷极难用一般方法分离，经反复结晶后，在纸色谱及聚酰胺色谱上都只有一个斑点，易误认为单一成分，但测其熔点在115～125℃，熔距很长。经制备其甲醚衍生物后，进行纸色谱检查，则出现两个斑点，异高熊果苷衍生物的Rf值大于高熊果苷衍生物的Rf值。

因此，判定结晶纯度时要依据具体情况加以分析。也可以利用高压液相色谱、气相色谱、紫外光谱等多种方法确定结晶样品的纯度。

四、色谱法

色谱法是基于混合物中各组分在两相（固定相和流动相）之间的分配不均匀的性质进行分离的一种方法。混合样品被导入固定相的支持体中，另一流体即流动相通过时，由于样品中各组分与固定相和流动相的相互作用（包括范德华力、氢键等）大小的不同，各组分通过固定相支持体的速率也不同，从而得以分离。色谱法可根据两相所处的状态分类，使用液体作为流动相称为液相色谱，使用气体作为流动相称为气相色谱。同时又根据固定相的不同，液相色谱可再分为液-固色谱和液-液色谱，气相色谱可再分为气-固色谱和气-液色谱。

另一种是按色谱过程的机理（表2-3）来分类：利用吸附面对不同组分吸附性能的差异进行分离鉴定的称为吸附色谱；利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数差异而进行分离的称为分配色谱；利用分子大小不同引起的阻滞作用不同进行分离的称为排阻色谱（或凝胶色谱）；利用不同组分对离子交换剂亲和力差异进行分离的称为离子交换色谱。

在天然产物的分离过程中，最常用的方法是将不同固体固定相灌装成不同类型的色谱柱来实现，这样的方法称为柱色谱；另一种方法是将固定相固定于玻璃或塑料等材料表面从而形成固定相薄层来使用，则称为薄层色谱。不同固定相的柱色谱的分离原理不同，综合运用便可分离制备不同类型的天然产物；薄层色谱和纸色谱则主要用于鉴定分析，也可用于半微量制备。下面将对常用色谱分离方法做简要介绍。

1.柱色谱法

（1）分配柱色谱

分配色谱与溶剂萃取法的原理相同，都是利用化学成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的差异进行分离的。

分配柱色谱是使用一种多孔物质吸附一种极性溶剂，这样极性溶剂在色谱过程中始终固定在支持剂上，形成固定相。另使用一种与固定相互不相溶的非极性溶剂进行洗脱，该洗脱剂在色谱过程中始终是移动的，即流动相。溶质在固定相和流动相之间，在柱上做连续地、动态地反复分配，从而利用不同成分在两相间分配系数的差异而得以分离。分离工作的难易主要取决于不同成分间分配系数差值，如果分配系数差值较大，只要用较小的柱和较少的固定相支持体用量便能获得理想的分离效果；如果相差极小，则同样质量的样品往往要用较大的柱和较多的固定相支持体才能分开。分配柱色谱（一般指液-液分配柱色谱）采用的载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。

通常，分离水溶性或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时，固定相多采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂，称之为正相分配柱色谱。在正相分配柱色谱中，极性小的成分先洗脱，极性大的成分后洗脱。而在分离脂溶性化合物如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时，则两相可颠倒，可用石蜡油等脂溶性溶剂作为固定相，而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂，故称之为反相分配柱色谱（reverse phase partition chromatography）。在反相分配柱色谱中，极性大的成分往往先被洗脱，极性小的成分则后被洗脱。

反相柱色谱的常用填料是将普通硅胶经化学修饰（图2-15）键合长度不同的烃基（—R）形成亲脂性表面而成。根据烃基（—R）长度为乙基（—C2H5）还是辛基（—C8H17）或十八烷基（—C18H37），分别命名为RP（reverse phase）-2、RP-8及RP-18。三者亲脂性强弱顺序为：RP-18＞RP-8＞RP-2。

经典分配柱色谱中所用的载体（如硅胶）颗粒直径较大（100～150μm），流动相仅靠重力作用自上而下缓缓流过色谱柱，流出液用人工分段收集后再进行分析，因此柱效较低，费时较长，现各种加压液相色谱已逐渐代替经典分配柱色谱。

无论是在分离效能或速度方面，加压液相色谱均远远超过了经典的液-液分配柱色谱方法，因而其在天然药物分离工作中得到了越来越广泛的应用。根据所用压力大小的不同，可分为快速色谱（flash chromatography，约2.02×105Pa）、低压液相色谱（LPLC，＜5.05×105Pa）、中压液相色谱（MPLC，5.05～20.2×105Pa）及高压液相色谱（HPLC，＞20.2×105Pa）等。各种加压液相柱色谱的大体分离规模如图2-16所示。

天然产物分离中经常遇到的问题是：长时间洗脱造成敏感化合物分解，并使色带拖尾。快速色谱技术可使分离所需时间大大缩短，从而避免上述问题发生。使用最广泛的快速色谱固定相为硅胶。天然产物的最终纯化可采用硅胶快速色谱法，但更常见的是用此方法对粗提物或混合物进行初步纯化，继而利用高分辨率的色谱技术进行纯化。

中压液相色谱可采用更长、具有更大内径的色谱柱，可以一次性分离更多的样品。中压液相色谱比常压液相色谱使用的填料颗粒度更小，分辨率更高，需使用更大的压力来维持适当的流速，所需压力可由压缩空气或往复泵提供。为提高效率，可先利用分析型HPLC有效地选择适当的溶剂系统。在天然产物分离中，中压液相色谱多采用硅胶或反相硅胶为固定相，但有时也采用聚酰胺或纤维素为固定相。

与中压液相色谱相比，高压液相色谱柱内填装粒度范围更窄的细小颗粒为固定相，需采用较高的压力使流动相流出。系统的复杂性及成本增大，但分辨率可得到较大的提高。许多分离工作需要从大量的粗提物中分离出微量成分，通常采用高压液相色谱进行最后阶段的制备分离。为使每次分离获得纯品的数量增加，制备型高压液相色谱分离通常使样品超载。制备型高压液相色谱分离大多采用恒定的洗脱剂条件，这样可减少操作中可能出现的问题。但是对于那些难分离的样品，有时也需采用梯度洗脱方式分离。

（2）吸附柱色谱

吸附色谱的原理是利用固体吸附剂（固定相）对混合物中各组分的吸附能力的不同而进行分离。液-固吸附色谱是运用较多的一种方法，更适用于中等分子量的样品（分子量小于1000的低挥发性样品）的分离，特别是脂溶性成分，而高分子量样品（如蛋白质、多糖或离子型亲水化合物等）的分离则一般不适用。

吸附剂、溶剂和被分离物质的性质是影响吸附色谱分离效果的三个最主要因素。

① 吸附剂　吸附剂即吸附柱色谱中的固定相，通过物理吸附或化学吸附作用将被分离物质产生吸附作用，常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、大孔树脂、硅藻土等。

a.硅胶　色谱用硅胶是一种多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸附的水分增加而降低。如果吸水量超过17%，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配色谱中的支持剂。当硅胶被加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去；当加热温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩合转变为硅氧烷键，丧失因氢键吸附水分的活性，不再有吸附剂的性质，即便用水处理也不能再恢复其吸附活性。因此硅胶的活化不宜在较高温度下进行，一般在170℃以上即有少量结合水失去。

硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的分离。硅胶不适用于碱性物质的分离，这因为硅胶也是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物，可因发生离子交换反应而吸附碱性化合物。

b.氧化铝　因氧化铝中可混有碳酸钠等成分，其可能带有碱性，对于分离一些碱性天然产物，如生物碱类成分的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、内酯等类型化合物的分离，因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中碱性杂质，用水洗至中性，称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，用途最广，适用于生物碱、萜类、甾体、挥发油及在酸碱中不稳定的苷类、内酯类等化合物的分离，不适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有N或Cl-，从而具有离子交换剂的性质，适合于酸性成分的分离，这种氧化铝称为酸性氧化铝。

c.聚酰胺　聚酰胺是一类由酰胺聚合而成的高分子物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。商品名为锦纶、尼龙。

聚酰胺对于一般的酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的（鞣质例外），分离效果好，加之吸附容量又大，故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离。此外，其对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其他极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。另外，因聚酰胺对鞣质的吸附力特强，近乎不可逆，所以其也特别适宜用于植物粗提取物的脱鞣处理。

d.大孔吸附树脂　大孔吸附树脂是一种人工合成的具有多孔立体结构的聚合物吸附剂，含有无数的网状孔穴结构，一般为白色球形颗粒，通常分为非极性和极性两类。因其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒，所以广泛应用于天然化合物的分离与富集操作中。对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物的影响。国内常见的用于提取分离的大孔树脂类型有D101型、DA201型、SIPI系列等。

大孔吸附树脂是具有吸附性和分子筛原理的分离材料，它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。本身多孔性结构的性质决定了其具有分子筛的性质。天然化合物的分离和富集现已广泛应用于大孔吸附树脂，如苷与糖类的分离、生物碱的精制等。在多糖、黄酮、三萜类化合物的分离方面都有很好的应用实例。

② 溶剂　色谱过程中溶剂的选择，对组分分离影响极大。使用柱色谱时所用的溶剂（单一溶剂或混合溶剂）一般称为洗脱剂，使用薄层或纸色谱时常称展开剂。选择洗脱剂需根据被分离物质与所选用的吸附剂性质，将两者结合起来加以考虑。在用极性吸附剂进行色谱时，若被分离物质为弱极性成分，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；若被分离物质为强极性成分，则需选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦需相应降低。

据此，支配吸附过程的主要因素是极性强弱。所谓极性，它是一种抽象概念，用以表示分子中电荷不对称的程度，并大体上与偶极矩、极化度及介电常数等概念相对应。那么极性又应当如何判断呢？

a.官能团的极性强弱按图2-1顺序排列。

b.溶剂极性的大小大体上可以根据介电常数（ε）的大小来判断。常用溶剂的介电常数及其极性排列如表2-4所示。

c.洗脱用溶剂的极性宜逐步增加，跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂，并通过调节比例以改变极性，达到梯度洗脱分离物质的目的。一般情况下，混合溶剂中强极性溶剂的影响比较突出，故不可随意将极性差别很大的两种溶剂组合在一起使用。实验室中最常应用的混合溶剂组合如图2-17所示。在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以30～60min内流出液体的体积（mL）与所用吸附剂的质量（g）相等为合适。

d.大孔树脂吸附色谱中，洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。根据吸附作用的强弱，选用不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂。对非极性大孔树脂，洗脱液极性越小，洗脱能力越强；对于中等极性的大孔树脂和极性较大的化合物来说，则选用极性较大的溶剂较为适宜。

③ 被分离物质的性质　在吸附剂与洗脱剂指定的条件下，各个成分的分离效果直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，若成分的极性大，则吸附力强。

被分离物质的极性则取决于分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素。以氨基酸来说，分子结构中既有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸，如硬脂酸，虽也含有如羧基这样的强极性基团，但因分子的主体是由长链烃基所组成，故极性依然很弱。中药大黄中的主要成分为蒽醌化合物，包括大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸等，它们结构差别仅在R1、R2基不同，故极性大小取决于R1、R2的种类表2-5，极性大小顺序为：大黄酸（COOH）＞大黄素（Ar-OH）＞芦荟大黄素（CH2OH）＞大黄素甲醚（OCH3）＞大黄酚（H）。极性强弱顺序决定着这些化合物在硅胶上的吸附行为及柱色谱的洗脱规律。

应当强调指出，酸性、碱性及两性有机化合物的极性强弱及吸附行为主要由其存在状态（游离型或解离型）所决定，并受溶剂pH的影响。以生物碱而言，游离型为非极性化合物，易为活性炭所吸附；但解离型则不然，为极性化合物，不易为活性炭所吸附。因此实践中常可通过改变溶剂pH以改变酸性、碱性及两性化合物的存在状态，进而影响其吸附或色谱行为达到分离精制的目的。

④ 聚酰胺柱色谱的分离原理

前面介绍的硅胶及氧化铝吸附剂，通常认为是通过物理性吸附作用产生分离效果的，但聚酰胺柱色谱的吸附原理则是由于聚酰胺树脂的分子内有很多酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而对这些物质所产生的吸附作用，即所谓“氢键吸附”学说。

该理论认为：酚类（包括黄酮体、鞣质等）和酸类的羟基（或羧基）与锦纶分子中酰胺键的羰基形成氢键；芳香硝基化合物（包括DNP-氨基酸）和醌类的硝基（或醌基）与锦纶分子中酰胺键的游离氨基形成氢键。其吸附原理可用图2-18表示。

形成氢键缔合的能力与溶剂有关，一般在水中形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。由于各种化合物与聚酰胺形成氢键的能力不同，聚酰胺对他们的吸附力也不同。在含水溶剂中通常有如下大致规律：

a.形成氢键的基团数目越多（如酚羟基、羧基、醌基、硝基等），则吸附能力越强。如：

b.形成氢键的位置与吸附力有很大关系。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附也相应减弱。如：

c.分子中芳香化程度越高、共轭双键越多，则吸附性越强；反之，则弱。如：

以上仅对化合物本身对聚酰胺的亲和力而言。但因为吸附是在溶液中进行，所以溶剂也会参与吸附剂表面的争夺，或者通过改变聚酰胺对溶质的氢键结合能力而影响吸附过程。在水溶液中加入碱或酸均可以破坏聚酰胺与溶质之间氢键的缔合，也有很强的洗脱能力，可用于聚酰胺的精制及再生处理。常用的聚酰胺再生剂有10%醋酸、3%氨水及5%氢氧化钠水溶液等。

但是，随着聚酰胺色谱的不断发展，有许多现象难以用“氢键吸附”来解释。如某些很难与聚酰胺形成氢键的物质，如萜类、甾体、生物碱等也可用聚酰胺色谱分离；又如黄酮苷元与苷的分离，若用非极性溶剂作洗脱剂，黄酮苷元比其苷先洗脱下来。后者无法用“氢键吸附”解释。于是某些学者认为聚酰胺具有“双重色谱”的性能。因为聚酰胺分子中既含有非极性的脂肪链，又含有极性酰胺基团。当用极性流动相（如含水溶剂系统）洗脱时，聚酰胺为非极性固定相，其色谱行为类似于反相分配色谱。因黄酮苷比其苷元极性大，故黄酮苷比苷元更容易洗脱。当用非极性流动相（如氯仿-甲醇）洗脱时，聚酰胺则作为极性固定相，其色谱行为与正相分配色谱类似。因黄酮苷元比其苷极性小，故此时黄酮苷元比苷容易洗脱。这样则使聚酰胺色谱中一些用“氢键吸附”难以解释的现象得以解释。

各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱到强，可大致排列成以下顺序：

水→甲醇→丙酮→氢氧化钠水溶液→甲酰胺→二甲基甲酰胺→尿素水溶液

聚酰胺的“双重色谱”的性能只适用于解释难与聚酰胺形成氢键或形成氢键的能力不太强的化合物，如萜类、甾体、生物碱、糖类及某些酚类、黄酮、酸类等。它对于寻找这些化合物的聚酰胺色谱溶剂系统及推测这些化合物的结构特征有一定的指导意义。

（3）凝胶柱色谱

① 原理　凝胶滤过法是20世纪60年代发展起来的一种分离分析技术，其使用的固定相是凝胶，是具有许多孔隙的网状结构的固体，有分子筛的性质。其中所用载体如葡聚糖凝胶是在水中不溶但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间网状结构。当加入试样混合物，用同一溶剂洗脱时，由于受凝胶网孔半径的限制，大分子不渗入凝胶颗粒内部（被排阻在凝胶粒子外部），因此在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先行流出；小分子因为可以自由渗入并扩散到凝胶颗粒的内部，因此通过色谱柱时阻力增大、流速变缓，较晚流出。试样混合物中的各个成分因为分子大小各异，渗入扩散至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间的流动并达到动态平衡后，即按分子由大到小顺序先后流出而得到分离（图2-19），此法称为凝胶滤过法（gelfiltration）也叫凝胶色谱法（gelchromatography）。该方法在蛋白质及多糖等大分子化合物的分离中应用较普遍。

② 凝胶的种类与性质

商品凝胶种类很多，常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex G）以及羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）。

a.葡聚糖凝胶　它由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂（一般为环氧氯丙烷）以醚桥的形式相互交联形成，是水不溶性的白色球状颗粒，在酸性环境中能水解，在碱性环境中稳定。凝胶颗粒的表面有许多孔隙，其孔隙的大小由葡聚糖与交联剂的配比及反应条件决定。交联度越大，网状结构越紧密，孔隙越小，吸水膨胀就越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，孔隙越大，吸水膨胀就越大。商品型号是按凝胶的交联度大小分类，并以吸水量来表示：英文字母G代表葡聚糖凝胶，后面的阿拉伯数字为凝胶的吸水量再乘以10的值。例如：G-25的吸水量为每克葡聚糖凝胶吸水2.5毫升。

b.羟丙基葡聚糖凝胶　在交联葡聚糖分子上引入一个基团，则会增大其亲脂性。如LH-20型交联葡聚糖凝胶，便是在G-25上引入羟丙基基团。与Sephadex G比较，Sephadex LH-20分子中羟基总数虽然没有改变，但碳原子所占比例却相对增加了。因此，与Sephadex G不同，Sephadex LH-20不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂（如氯仿、丁醇、四氢呋喃、二氧六环等）或它们与水组成的混合溶剂中溶胀后应用，但是在甲苯、乙酸乙酯中溶胀不多。这种凝胶在pH大于2的无氧化剂溶液中稳定。表2-6表示Sephadex LH-20在不同溶剂中湿润膨胀后得到的柱床体积及保留溶剂数量。

Sephadex LH-20的使用方法类似于一般交联葡聚糖凝胶。用低级醇为溶剂时，芳香族、杂环化合物在凝胶上有阻滞作用；但用氯仿作溶剂时，这些化合物不受阻滞；而其对含羟基与含羧基的化合物也有阻滞作用。

Sephadex LH-20适用于分离有机物质，如脂类、固醇类、保护多肽和脂溶性维生素等。吸水量为2mL/g干凝胶，分离范围为100～2000和100～20000两种（在氯仿中）。其中羟丙基[HO（CH2）2CH2O—]还可以根据需要将烷烃加长，加长至11～14和15～18个碳原子，这种凝胶分辨率更高。

（4）离子交换柱色谱

离子交换树脂是一种合成的呈球状或无定形粒状的高分子化合物，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。根据它的解离性能大小，各类树脂还可分为强、中、弱等。阳离子交换树脂中的解离性基团为磺酸（—SO3H）、磷酸（—PO3H2）、羧酸（—COOH）和酚性羟基（—OH）等酸性基团。阴离子交换树脂中含有季铵、伯胺、仲胺、叔胺等碱性基团。

离子交换法可以用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等的分离。使用离子交换树脂，特别是对水溶性成分的分离，比以前方便得多。

① 有效部位的分离　民间使用中药时多用煎剂，一般可将水煎剂通过强酸性（磺酸型）阳离子交换树脂，再通过强碱性（季铵型）阴离子交换树脂，分别洗脱，分成酸性、中性、碱性部位供动物或临床试验，如图2-20。

② 生物碱的分离　从中药水浸液或稀乙醇提取液或者乙醇提取部位的水溶部分直接分离生物碱可用强酸性阳离子交换树脂，即先用氨水或氨性乙醇洗脱，所得部位再用其他分离手段分离。该法由于树脂是可反复使用的，特别对水溶性生物碱的提取分离，较经典方法方便有利。

③ 有机酸及酚性物质的提取分离　用离子交换色谱法能理想分出多种有机酸。

④ 氨基酸的提取分离　离子交换色谱是分离氨基酸的有效方法，一般使用不同pH的缓冲液梯度洗涤以达到分离的目的。目前的氨基酸自动分析仪也是利用离子交换色谱法设计成的。

2.薄层色谱法

薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）相对于柱色谱而言，分离效果好，分析速度快，操作简单，在各个学科中均有广泛应用。一般是将吸附剂均匀地涂在玻璃、金属或塑料等表面上，形成薄层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。待分离物质在吸附剂和展开剂之间产生多次吸附-溶解，混合物中各组分被分离成孤立的样点，实现化合物的分离。

（1）薄层色谱条件

① 固定相选择　同柱色谱类似，薄层色谱最常用的固定相主要是硅胶、氧化铝、聚酰胺等，但薄层色谱吸附剂的粒度更小，市场上可购买到薄层色谱专用的吸附剂，如硅胶H。分离亲脂性化合物时常用氧化铝和硅胶；分离亲水性化合物时常用反相色谱填料或聚酰胺。

② 展开剂选择　展开剂选择时，应考虑混合样品中各组分的极性以及溶剂对样品中各组分的溶解能力，且通常选择使用混合溶剂组合以方便调整展开剂极性。以最常用的硅胶薄层色谱而言，展开剂极性越大对化合物的洗脱能力越强，一个合适的混合溶剂展开剂组合，应当能使样品的组分在薄层中展开适当的距离。若混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿附近，则说明展开剂的极性过强，应增大小极性溶剂的比例；若混合物中的组分点留在了原点上，说明展开剂的极性过弱，应增大大极性溶剂的比例；反复试验，直到选出合适的展开剂组合。

③ 比移值　薄层色谱的比移值（Rf）是指样品的点在薄层色谱上移动的距离与溶剂移动距离之比，是薄层色谱的基本定性参数。从点样原点开始到展开后的溶剂前沿，是溶剂的移动距离，记为l0，混合物中各组分的移动距离分别记为l1，l2，l3，…，l i，则比移值可表示为Rf=l i /l0。在相同条件下测得的比移值可以用作化合物的薄层色谱特征值进行比较对照。当Rf值为0时，表示组分留在原点未被展开，当Rf值为1时，表示组分随展开剂至溶剂前沿，即组分不被固定相保留。在以薄层色谱选择柱色谱条件时，Rf值以0.2～0.3较为适宜，此时的溶剂系统即为一般柱色谱分离组分的最佳溶剂系统。

④ 显色　如果被分离的化合物有颜色，则很容易识别出来各个样点。但多数情况下，化合物一般没有颜色，要识别样品，必须使用显色剂。通用的显色方法有碘蒸气显色和紫外显色，也可喷5%硫酸乙醇加热显色，不同类型的天然产物需尽量针对性地使用特征显色剂。

（2）薄层色谱操作

① 薄层板的准备　薄层板可自己铺制，但多数情况都是直接购买预先铺好的薄层板。然后用玻璃刀按需要切割成2cm×10cm、5cm×10cm、10cm×10cm等规格。如果进行制备薄层层析，可以使用20cm×20cm的预制薄层板。

② 点样　使用点样器或毛细管吸取样品后，在距离薄层板底边1.0～1.5cm的基线上点样，一般为圆点，样点直径不大于2mm，若样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样溶剂挥发后才可重新点样，以免样点过大造成拖尾、扩散等现象而影响分离效果。做制备薄层层析时，在距离薄层板底边约1.5cm，两边各1cm，用微量注射器或毛细管吸取试样溶液，可以来回点成线条状，线条宽度不得超过2mm。点样时必须注意勿损伤薄层表面。

③ 展开　在点样完成之后，将薄层板放入盛有展开剂的层析缸中（浸入展开剂的深度为距离原点5mm较为适宜），密封，待薄层板展开至规定距离（一般为8～15cm），取出薄层板，吹干溶剂，待检测。层析缸如需预先用展开剂预平衡，可在缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30min即可。

④ 显色与检视　如果样品在可见光下有颜色，则可直接在日光下检视，也可用喷雾或浸渍法，以适宜的显色剂显色，或加热显色。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外灯下观察荧光。对于在可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如GF254板），在254nm紫外灯下观察。

（3）薄层色谱的应用

① 判断两个化合物是否相同。

② 确定混合物中含有的组分数。

③ 柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果。

④ 检测反应过程。

3.纸色谱法

纸色谱以滤纸作为支持体，依靠样品在两相间分配系数的差异达到分离目的。滤纸纤维常常能吸收20%～25%的水分，其中6%～7%的水是以氢键形式与纤维素上的羟基结合，一般较难脱去。所以常规的纸色谱固定相实质上是水，流动相是以水饱和的有机溶剂。此时相当于正相分配色谱，极性大的成分Rf值较小，后洗脱出来。

如果滤纸用石油醚或硅油处理后作为固定相，以水溶液（或有机溶剂）作为流动相，此时相当于反相纸上分配色谱。极性大的成分Rf值较大，先洗脱出来。

近年来，由于薄层色谱的快速发展和广泛应用，其相比纸色谱在很多方面显示出更强的优越性，但纸色谱在糖类、氨基酸等大极性化合物的分离、分析中仍具有其独特的应用价值。操作过程中应注意以下几点。

（1）滤纸的选择

滤纸质地要均一，厚薄要适宜、平整无折痕，杂质要少。若含有过多的杂质，会影响分析的结果。一般定性分析需要用较薄的滤纸，而分离制备则需要厚质滤纸。

（2）展开剂的选择

纸色谱的展开剂常由有机溶剂和水组成，往往不是单一溶剂，如常用的正丁醇-水，是指水饱和的正丁醇；而展开系统正丁醇∶乙酸∶水（4∶1∶5）则是将溶剂先按此比例混合，然后置分液漏斗中静置分层，取上层正丁醇溶液作为展开剂。展开剂的选择可以根据文献报道的类似化合物常用的展开系统来加以改善，原则上要求待分离样品的各组分在该溶剂系统中的Rf值差异较大，且该系统对样品有良好的溶解性能，不会与样品发生化学反应，组成的比例也不应受温度影响。

（3）点样

样品的浓度一般配制成0.5～15mg/mL的溶液（适宜的浓度要根据预试验确定，不同成分有所差异），然后用毛细点样管（定量时采用刻度毛细管或微量注射器点样）点于离滤纸底边2～4cm的点样线上。点样的斑点直径不应超过0.5cm，点样时可以采用少量多次点样的方法，每次点少量样品后立即用电吹风吹干，再进行下一次的点样，这样可以避免样品斑点的扩散过大；如果同一张滤纸上点多个样品，样品之间的距离则不可太近，以2cm以上较为适宜，这样可以避免样品展开后相互干扰；点样量不宜过大，超载会出现拖尾现象，影响分离效果，以10～30μg较为适宜。

4.其他分离方法与技术

（1）逆流色谱法

逆流色谱（counter-current chromatography，CCC）是基于某一样品在两个互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中的各个组分在通过两溶剂相的过程中按不同的分配系数得以分离。这是一种不用固态支持体的全液态的分配色谱方法。逆流色谱是在逆流分溶法的基础上发展起来的，这种方法早在20世纪40年代至50年代建立，它具有混合物断续地分流和连续地分流两种方式。

在液-液分配色谱基础上创建的液滴逆流色谱（droplet counter current chromatography，DCCC）可使流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离。

高速逆流色谱（high-speed counter current chromatography，HSCCC）是一种较新型的液-液分配色谱，分离原理（图2-21）是基于样品在旋转螺旋管内互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离。

HSCCC具有如下优点：

① 应用范围广，适应性好　因为溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，所以从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围样品的分离，特别适用于分离极性物质。

② 操作简便，容易掌握　分离过程中对样品的前处理要求低，一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。

③ 回收率高　由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100%。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。

④ 重现性好　如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都能保持很好的稳定性，峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。

⑤ 分离效率高，分离量较大　因为其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作，也能进行重复进样，特别适用于制备性分离，产品纯度高。

逆流色谱可克服上述液相色谱中由于采用固体载体而引起的不可逆吸附消耗、试样变性污染及色谱峰畸形拖尾等弊病，试样还可以定量回收，目前已广泛用于皂苷、生物碱、酸性化合物、蛋白质、糖类等天然化合物的分离精制工作，并取得了良好的效果。

（2）膜分离技术

① 分离原理　膜分离主要是使用选择性的透过膜作为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如电位差、压力差、浓度差等）时，原料侧组分选择性地透过膜而达到分离、提纯的目的。

② 膜分离技术的特点　同传统分离方法相比，膜分离对中药体系有其特殊的优势：分离时没有相变，尤其是用于中药中热敏性物质的分离、浓缩；分离不消耗有机溶剂（尤其是乙醇），可缩短生产周期，降低有效成分的损失，而且有利于减少环境污染；分离选择性高，选择合适的膜材料进行过滤可以截留中药提取液中的鞣质、淀粉、树脂和某些蛋白质，且不损失有效成分，制剂的质量可提高；膜分离适用范围广，从去除热原、细菌等固体微粒到分离溶液中有机物和无机物；可实现连续化和自动化操作，容易与其他生产过程匹配，满足中药现代化生产的要求。

③ 分离膜的类型　根据分离的功能，膜可分为微滤膜（≥0.1μm）、超滤膜（10～100nm）、纳滤膜（1～10nm）、反渗透膜（≤1nm）几类。

a.微滤膜　微滤是最早使用的膜技术。以多孔薄膜为过滤介质，使不溶物质浓缩过滤。截留的范围为0.1～10μm，可应用于截留颗粒物、液体的澄清以及去除大部分细菌，并作为超滤、反渗透过程的前处理。

b.超滤膜　超滤膜上的微孔具有不对称的结构。超滤的分离技术原理近似于机械筛，溶液经由水泵进入超滤器后，在滤器内超滤膜的表面发生分离，当溶剂（水）和其他小分子溶质透过具有不对称微孔结构的滤膜时，大分子溶质和微粒（如蛋白质、病毒、细菌、胶体等）便被滤膜所阻留，液体分离过程中，大分子溶质的微粒随溶液切向流经膜表面时，由于液体的快速堵塞，小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过致密层上的微孔后，即能顺利穿过下部的疏松支撑层，进入膜的另一侧，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。超滤膜在长期连续运行中保持较恒定的产量和分离效果，可长期、反复使用。

超滤膜能截留分子量在几千至数十万的大分子，除能完成微滤的除颗粒、除菌和澄清作用外，还能除去微滤膜不能除去的病菌、热原、胶体、蛋白等大分子化合物，主要用于物质的分离、提纯和浓缩，在医药行业中超滤膜是发展最快的膜分离技术。

c.纳滤膜　纳滤膜是近年来国外发展起来的另一滤膜系列——纳米过滤。介于反渗透与超滤之间，它能分离除去分子量在300～1000之间的小分子物质，填补由超滤和反渗透所留下的空白部分。纳滤膜集浓缩与透析为一体，可使溶质的损失降到最小。

d.反渗透膜　反渗透膜是从水溶液中除去无机盐以及小分子物质的膜分离技术。反渗透所用材料为有机膜，其分离特点是仅能透过小分子溶剂，截留各种无机盐、金属离子和低分子量的分子。在医药行业中反渗透膜的应用主要是制备各种高品质的医用水、注射用水和医用透析水，可替代离子交换树脂，主要用于水的脱盐纯化。

④ 膜分离技术的应用

a.中药提取液的纯化　桂枝茯苓胶囊应用微滤和超滤膜分离技术精制，使活性成分苷类、酚类等在常温环境下实现物质分离，有效脱除杂质。此工艺既克服了常规分离法容易造成分子量小于1000的活性物质流失、无效大分子（分子量大于5×104）不易分离的缺点，又不引起成分变化，无二次污染，丰富了中药成品的精制手段，具有很大的潜在优势。

b.制备中药口服液　各种中药口服液的制备实验研究中也有采用膜分离技术。比如采用超滤法和醇沉法对黄连解毒汤的水提物进行纯化，并测定其主要成分小檗碱的回收率及残渣去除率。结果显示，超滤法比醇沉法能更多地去除料液中的杂质而保留有效成分，既节省乙醇试剂用量，又简化工序，生产周期大大缩短。

c.制备药酒等其他中药制剂　膜分离技术用于药酒生产可提高药酒的澄明度。对提高成品的内在质量、稳定性和澄明度都显示出良好的效果，提高了产品的营养及功能。

d.热原（内毒素）的去除　热原对人体的危害相当大，热原注入人体能引起急性高烧、寒战和白细胞增高，有的发生急性休克甚至死亡。膜分离法是一种除热原的新技术，并正在中药行业中推广应用，目前主要用于去热原注射用水和注射液的制备。美国和日本等国家的药典已允许大输液除热源采用超滤技术。

（3）高速离心法

① 分离原理　高速离心法是以离心机为主要设备，通过离心机的高速转动，离心加速度超过重力加速度成千上万倍，使提取液中的大分子杂质沉降速度增加，加速杂质沉淀并使其除去的一种方法。目前使用的离心机主要有沉降式离心机、管式离心机、蝶片式离心机、过滤式离心机、三足式离心机、卧式刮刀离心机、活塞推料离心机等。

② 高速离心法的应用

a.用于制备口服液　高速离心法应用于中药口服液生产，可使药液基本澄清，在其分离过程中能有效防止中药有效成分损失，最大限度地保存中药的活性成分，而且使工艺流程大为缩短、成本降低。在黄芪口服液的生产工艺研究中对比水提醇沉法与高速离心法的差异，以产品中黄芪甲苷、黄芪多糖含量为评价指标，结果发现前者成本高、多糖损失大，而高速离心法则提高了有效成分含量，节省了大量物料，降低了生产成本，而且简便易行，适宜工业化生产。

b.用于制备口服颗粒剂　在乙肝冲剂及缩宫止痛冲剂的生产工艺中，采用高速离心法代替醇沉法制备流浸膏，通过多品种多批次验证，结果表明高速离心法能替代醇沉法，生产的冲剂溶解度、澄明度均能达到规定要求，且能够缩短生产周期，降低生产成本，还能显著降低颗粒剂用量，提高每克颗粒中有效成分的含量，达到除杂的目的。

c.用于制备中药胶囊剂　在中药胶囊剂的生产工艺中，浸膏的制备是一个重要环节，传统醇沉工艺所得浸膏黏性大，难以干燥，易吸潮，且服用剂量大，患者不易接受。在宫瘀胶囊成型工艺研究中，分别采用板框式压滤和高速离心法除杂，考查其浸膏性状、干膏粉吸湿性和流动性，以确定除杂方法。结果显示，中药提取液经过高速离心机除杂后，浸膏的黏性降低，便于干燥，节省时间，干浸膏质地松脆，易于粉碎，浸膏粉有较好的流动性，临界相对湿度明显降低，非常适于大生产。

（4）分子蒸馏技术

自20世纪30年代出现以来，分子蒸馏技术得到了世界各国的重视。到20世纪60年代，已成功地应用于从鱼肝油中提取维生素A的工业化生产。相比较而言，我国分子蒸馏技术研究起步较晚。

① 分离原理　分子蒸馏技术的分离原理是利用液体分子受热会从液面逸出，而不同种类分子逸出后其平均自由程不同这一性质来实现的。该技术的核心是分子蒸馏装置。液体混合物为达到分离的目的，首先进行加热，能量使足够的分子逸出液面，轻分子的平均自由程大，重分子的平均自由程小，在离液面小于轻分子的平均自由程而大于重分子平均自由程处设置捕集器，使得轻分子不断被捕集，从而破坏了轻分子的动平衡而使混合液中的轻分子不断逸出，而重分子因达不到捕集器很快趋于动态平衡，不再从混合液中逸出，这样，液体混合物便达到了分离的目的，其分离原理示意图见图2-22。主要结构装置则由加热器、捕集器、高真空系统组成。

② 分子蒸馏技术的特点　分子蒸馏技术不同于一般蒸馏技术。它是运用不同物质分子运动自由程的差别而实现物质的分离，因而能够实现远离沸点下的操作。与常规蒸馏技术相比，其具备以下优点：

a.操作温度低　常规蒸馏是靠不同物质的沸点差进行分离，而分子蒸馏是靠不同物质分子运动自由程的差别进行分离，因而可在远低于沸点下进行操作。

b.蒸馏压力低　由于分子蒸馏装置独特的结构形式，其内部压力极小，可获得很高的真空度。

c.受热时间短　鉴于分子蒸馏是基于不同物质分子运动自由程的差别而实现分离的，故受加热面与冷凝面的间距要小于轻分子的运动自由程（即距离很短），这样由液面逸出的轻分子几乎未碰撞就到达冷凝面，所以受热时间很短。另外，如果采用较先进的分子蒸馏结构，使混合物的液面达到薄膜状，这时液面与加热面的面积几乎相等，那么，此时的蒸馏时间则更短。假定真空蒸馏受热时间为1h，而分子蒸馏仅用十几秒。

d.分离程度高　分子蒸馏常常用来分离常规蒸馏不易分开的物质，然而就两种方法均能分离的物质而言，分子蒸馏的分离程度更高。

③ 应用　分子蒸馏技术的优点在于可大幅度降低高沸点物料的分离成本以及分离热敏性物质，目前该项技术已广泛应用于高纯物质的提取，特别适用于天然物质的提取与分离。如用分子蒸馏从天然鱼肝油中获得浓缩维生素A，提取天然或合成维生素E及β-胡萝卜素，从动植物中提取天然的鱼油、米糠油、小麦胚芽油等；在食品工业中常用于混合油脂的分离，可获得纯度达90%～95%以上的单脂肪酸酯，如硬脂酸单甘油酯、月桂酸单甘油酯、丙二醇酯等；另外，在农药的精制、石油化工、香精、香料工业、塑料工业等都有重要的应用，详细内容读者可根据参考相关文献进行深入学习。