第二节　波谱分析在结构测定中的应用

目前，随着波谱技术的飞速发展，应用紫外吸收光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）和质谱（MS），使天然药物化学结构测定变得越来越方便、快捷。尤其是超导核磁共振技术、二维核磁共振（2D-NMR）及质谱新技术的发展，使得测试工作对化合物的用量要求越来越少，但灵敏度却不断提高，速度也更快，准确性更高。这里仅简要介绍这些波谱技术在天然药物有效成分结构鉴定中的应用，详细内容可学习参考书目和文献。

一、紫外吸收光谱

紫外吸收光谱（ultraviolet absorption spectra，简称紫外光谱，UV）的分子吸收波长位于200～400nm之间。UV不仅可以用于化合物的含量测定，还可以用于化合物的结构鉴定。测定紫外光谱仅需少量纯样品。紫外光谱在天然药物化学结构鉴定中主要用于推断分子中共轭双键、不饱和羰基（醛，酮，酸，酯）等共轭体系以及助色团的存在，还可通过加入诊断试剂用于香豆素类、黄酮类等化合物的精细结构的推定。

图4-1为常见化合物槲皮素的紫外图谱（横轴为波长，纵轴为吸收度A）。由于黄酮醇类的分子结构中有桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故其溶液在200～400nm的区域内存在两个紫外吸收带。反之，如未知化合物的紫外图谱出现类似的紫外吸收带，即可推测其属于黄酮类化合物。当然，很多类型完全不同的化合物均可能产生相似的吸收带，所以通过紫外谱图并不能完全确定其结构类型。

二、红外光谱

红外光谱（infrared spectra，IR）是研究红外光与物质分子间相互作用的吸收光谱，它是由分子中价键的伸缩及弯曲振动在光的红外区域即4000～500cm-1处引起吸收产生的。红外光谱通常只需要很微量的化合物便可测定。图4-2为槲皮素的红外光谱。图谱中1300cm-1以上为化合物的特征基团区，1300～500cm-1为指纹区。

为了方便解析红外光谱，通常又把特征区和指纹区分得更细，初步划分为八个重要区段，见表4-3。

如果被测定物是已知物，只需和已知对照品做一张红外光谱图，如果二者红外光谱完全一致，则可推测是同一物质。如无对照品，也可检索有关红外光谱数据或图谱文献。如果被测物结构基本已知，可能某一局部构型不同，在指纹区就会有差别，如25R与25S型螺甾烷型皂苷元，在960～900cm-1附近有显著区别，很容易鉴别。红外光谱对未知结构化合物的鉴定，主要用于官能团的确认、芳环取代类型的判断等。

三、核磁共振谱

核磁共振谱（nuclear magnetic resonance spectra，NMR）是基于具有磁矩的原子核（如1H、13C）在核外磁场作用下吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。NMR的各种技术，如氢谱、碳谱、同核（1H-1H、13C-13C）及异核（1H-13C）二维相关谱，能提供分子中H或C的类型、数目、连接方式、化学环境、构型、构象的结构信息。目前，几个毫克的微量物质甚至单用NMR测定技术也可确定它们的分子结构。因此在进行天然药物化学成分的结构测定时，NMR谱与其他谱相比，其作用尤为重要。

1.氢核磁共振谱（1H-NMR）

1H的自然丰度最大，信号灵敏度也高，故1H-NMR的测定比较容易，应用最广泛。1H-NMR谱可以提供不同化学环境氢原子的化学位移（δ）、相对数目、裂分情况及偶合常数（J）。

1H核的化学位移（δ）范围在0～20。因1H核周围化学环境不同，其外围电子云密度及绕核旋转产生的屏蔽效应不同，不同类型的1H核共振信号出现在不同区域，据此可以识别。1H-NMR谱上积分面积与分子中的总质子数相当，分析图谱时，只要通过比较共振峰的面积，就可判断氢核的相对数目。若化合物分子式已知，即可确定每个吸收峰所代表氢质子的绝对个数。

峰的裂分形状有单峰、双峰、三重峰、四重峰及多重峰。在低级偶合系统中，某一质子裂分后的峰数为n+1（n为干扰核的数目），裂分峰之间的距离称作偶合常数（coupling constant，J，Hz），表示相互作用力的强度。若间隔的键数越少，则J值越大；反之则越小。通常超过三根单键以上的偶合可以忽略不计（W型偶合和π系统中的偶合除外）。偶合常数相等的两个或两组1H相互偶合，这可以用来判断1H核之间是否相关。常见的氢谱图如4-3（槲皮素）所示，图中给出了各峰的化学位移值及裂分方式，并可计算它们的偶合常数。

为方便解谱，有时亦可采用双照射去偶和核Overhauser效应等实验方法把氢谱中复杂重叠的谱线简化并明确质子间的偶合关系。

（1）双照射去偶

运用同核去偶技术（homodecoupling），选择性照射（irradiation，IRR）偶合系统中的某个（组）（单照射）或某几个（组）质子并使之饱和，消除部分或完全消除相邻1H核的偶合影响，从而简化图谱。

（2）核Overhauser效应

在空间上相互接近的两个（组）不同类型质子，照射其中的一个（组）时，会使另一个（组）质子的信号强度增强，这种现象称为核的Overhauser效应（nuclear Overhauser effect，简称NOE）。先记录一个在某一位置去偶照射的氢谱，再选择一个远离照射位点的地方用相同的条件记录去偶1H谱，二谱相减，达到差谱。在差谱中，被保留的信号都是发生改变的，说明相关的质子在空间上是相互靠近的。此方法可以建立通过空间的连接，对化合物相对构型的确定十分有效。当结构解析缺乏通过键的连接信息时，它还能够提供有用的分子骨架的连接信息。

此外，还有许多其他的测定方法用以提供化合物的结构信息，如重水交换以判断活泼质子，改变测试溶剂或加位移试剂以测定溶剂位移或试剂位移，改变测试温度以判断氢键缔合或相对构型、构象的变化等，具体内容可参阅相关专著。

2.碳核磁共振谱（13C-NMR）

在决定有机化合物的结构时，与1H-NMR相比，13C-NMR起着更为重要的作用，可以提供化合物骨架的信息。但由于13C的磁旋比仅为1H的1/4，加之自然界的碳元素中，13C的丰度又只有1%，故13C-NMR的测定灵敏度只有1H-NMR的1/6000致使13C-NMR长期以来不能投入实际应用。脉冲傅里叶变换核磁共振装置（pulse FT-NMR）及计算机的使用让碳谱灵敏度大大增强，推动了碳谱的实际应用。天然产物的13C-NMR谱的化学位移范围为0～250，提供分子中不同类型及化学环境的碳核化学位移、异核偶合常数（JCH）及弛豫时间（T1），其中化学位移（δ）是最重要的信息。

（1）13C的信号裂分

由于1H的自然丰度比13C大得多，故在13C-NMR谱中1H对13C的偶合干扰尤为突出，而13C-13C之间的偶合干扰非常小，表现为微弱的“卫星峰”形式埋在噪声之中，可以忽略不计。1H核自旋偶合干扰产生的裂分数目依旧遵守n+1规律，以直接相连的1H的偶合影响为例，13C信号的裂分表现为S（C）、d（CH）、t（CH2）、q（CH3），1JCH=120～250Hz。并且除了1JCH影响外，还可能同时受到二根键（2JCH）及三根键（3JCH）的远程偶合影响，但2JCH和3JCH较小，故综合表现为具有细微结构的复杂图谱。为了使图谱容易辨认，现通常采用一定的技术来去除1H对13C的偶合影响。

（2）13C-NMR测定技术

① 质子宽带去偶谱（broad band decoupling，BBD）　即全氢去偶谱（proton complete decoupling，COM）。在去偶谱中（图4-4），1H受到宽频电磁辐射后达到饱和，可以消除其对13C的偶合影响。对于不含对称结构和F、P等元素的分子，每个单峰都代表一个碳原子且互不重叠。所以宽带去偶碳谱具有信号分离度好、强度高的优点，常用于确定分子中不等价碳的数目，以及测定各碳的化学位移值，但不能区别伯、仲、叔碳。另外，因照射1H后产生NOE现象，连有1H的13C信号强度增加，季碳信号因不连有1H，表现为较弱的峰。该技术应用最为普遍，通常现在所说的碳谱即指质子宽带去偶谱。

② DEPT谱（distortionless enhancement by polarization transfer）　通过改变照射1H的脉冲宽度（θ）或设定不同的弛豫时间（delay time），可使得连有不同数目1H原子的13C的信号在图谱上呈向上或向下的单峰，或者消失（图4-5）。DEPT谱具有较高的信号灵敏度和分辨率，也是常规的测定方法。

（3）13C信号的化学位移

13C-NMR谱与1H-NMR谱不同，化学位移的幅度较宽，约为200个化学位移单位，故信号之间很少重叠，识别起来比较容易。13C信号的化学位移同样也取决于周围的化学环境或磁环境，所以也可根据碳的化学位移值确认其类型。常见的碳的化学位移有苯的取代基位移、羟基的苷化位移（glycosylation shift）、酰化位移（acylation shift）等，在结构研究中均具有重要的作用。

3.二维核磁共振谱（2D-NMR谱）

二维谱是将一维NMR能够提供的氢化学位移、偶合常数和碳化学位移等信息在二维平面上展开绘制成的图谱，包括同核化学位移相关谱（如1H-1HCOSY谱和NOESY谱等）和异核化学位移相关谱（如13C-1H COSY谱，包括HMBC谱和HMQC谱等）。

（1）同核化学位移相关谱

① 1H-1H COSY　它是最常用的二维谱，是处于同一偶合体系的质子间偶合相关谱，用来判断质子偶合关系和连接关系。图谱以等高线图表示，对角线上的峰为一维谱，对角线两边相应的交叉峰与对角线上的峰连成正方形，该正方形对角线上的两峰即表示有偶合关系。因此，通过1H-1H COSY谱，从任一交叉峰即可确定相应的两峰的偶合关系，完全不用管（一维）氢谱中的峰形。例如，在青蒿素的1H-1H COSY（图4-6）谱中，可见H-11（δ 3.15）分别与H-13（δ 1.06）和H-7（δ 1.78）的交叉峰，从而说明H-11与H-13、H-7的偶合关系。

② NOESY　它是一种在二维谱上观测NOE效应的图谱，图谱呈方形，很像1H-1H COSY谱。对角线上有对角峰，对角线外显示相关峰，但这表示的是质子在空间位置上相互接近，而非通过键的相互偶合。因此，NOESY谱能提供分子相对立体化学和溶液构象方面的信息，是研究分子构型、构象和运动性的重要工具。如在青蒿素的NOESY（图4-7）中，可以看到H-7（δ 1.78），H-11（δ 3.15），H-14（δ 0.91）与H-9α（δ 1.00）相关，说明H-7，14-CH3，H-11与H-9α在分子平面的同侧。

③ TOCSY　在TOCSY谱中可以找到同一偶合体系中所有氢核的相关信息，也就是说从某一个氢核的信号出发，能找到与它处在同一个自旋系统中所有质子的相关峰，故又称全相关谱。显然TOCSY能够反应多级偶合需要依靠中间氢的传递接力，传递效果与偶合常数大小成正比，因此接力系统也会由于其中存在一个较小的偶合常数而中断。TOCSY谱对于含多个复杂自选偶合系统，特别是含多个糖或氨基酸单元的皂苷、环肽、多肽等天然产物的结构解析和氢质子的归属十分重要。图4-8为青蒿素的TOCSY放大谱，谱中可以从H-14（δ 0.91）出发，找到其与H-9（δ 1.63），H-1（δ 1.29），H-2（δ 1.32）和H-10（δ 1.51）的相关，说明这些氢均在同一自旋体系内，结合其他二维谱数据，就更方便确定具体结构片段。

（2）异核化学位移相关谱

① HSQC谱（异核单量子相关谱，heteronuclear single quantum coherence）　通过确定C-H偶合关系（1JCH）来反映1H核和与其直接相连的13C的关联关系。图谱的横轴为1H化学位移，纵轴为13C化学位移，分子中只有直接相连的1H和13C（1JCH）才会在图谱上对应的13C和1H化学位移的交点处给出相关信号。所以由相关信号分别沿两轴画平行线，就可将相连的13C与1H信号予以直接归属。例如，在化合物青蒿素的HSQC谱（图4-9）中，可找到对应的碳、氢的相关峰，并确定各直接相连的碳氢归属。

② HMBC谱（异核多键相关谱，heteronuclear multiple bond correlation）　图谱中横轴为1H化学位移，纵轴为13C化学位移，只有相隔2根键或3根键的1H和13C远程偶合相关（2JCH或3JCH）才会出现相关峰信号。由HMBC谱可以推断出的化合物信息十分丰富，包括碳链骨架的连接、有关季碳的结构信息及被杂原子切断的偶合系统相互之间的结构信息。近年来HMBC实验已在复杂天然活性成分结构中得到广泛应用。例如在化合物青蒿素的HMBC谱（图4-10）中可见H-14（δ 0.91）与C-9（δ 33.1）、C-10、C-1相关，从而证明14-CH3与C-10相连。

四、质谱

质谱（mass spectrum，MS）是于近一个世纪前发展起来的，它能够利用各种电离方法将分子电离和裂解，并将其产生的各种离子碎片按质荷比（m/z）大小排列。如今，质谱已成为天然药物化学研究中获得化合物结构片段、分子量及分子式的重要手段，尤其是高分辨质谱获得化合物分子式非常方便，可为波谱解析工作提供基础。

根据离子源的电离方式不同，质谱又包括了电子轰击质谱（EI-MS）、场解吸质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）、基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）等。EI-MS易于电离，产生的图谱包括了化合物的分子离子峰及丰富的碎片离子峰，但其不适合难以气化或热不稳定样品；FD-MS则相反，适用于难气化和热不稳定的固体样品，但碎片离子峰不够丰富；FAB-MS应用广泛，适用于测定各类天然产物的分子量和主要碎片离子，常用于难气化、热不稳定、高极性化合物，特别是糖苷类；ESI-MS是目前应用最广泛的，且电离方式很软，很少有碎片离子峰，既适用于分子量高达20000的大分子，也适用于分子量1000以下的小分子；MALDI-MS则常用来测定多肽、多糖等大分子，可得到分子离子、准分子离子和具有结构信息的碎片离子。

另外，如果质谱仪配有多个质量分析器就形成了串联质谱（tandem MS）。串联质谱可简单表示为MS/MS，随着串联级数的增加进而表示为MSn，其中n表示串联级数。它可以研究母离子和子离子的关系，获得裂解过程的信息，用以确定前体离子和产物离子的结构。从一级MS中得到有效部位中各成分的分子离子，再通过对各个分子离子进行二级至三级质谱分析，从而实现对有效部位中各种成分在未加分离的情况下分别快速鉴定的目的。

五、其他分析方法

除了常规的紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振谱外，还有其他一些结构解析中经常用到的用于确定化合物绝对构型的方法，如Mosher法、圆二色谱法（circular dichroism，CD）、晶体X-射线衍射法（X-ray diffraction method）。

Mosher法是利用手性衍生化试剂将手性仲醇样品转化为一对差向异构体，然后利用它们的NMR数据差异来判断手性仲醇的绝对构型。圆二色谱作为研究光学活性分子的重要光谱技术近几十年来已得到了广泛的研究与应用。在其理论基础上，通过利用分子中已有或引入的各种生色团的激子手性法，以及通过计算获得理论模拟图谱的计算圆二色谱法已成为研究天然产物绝对构型的重要途径。晶体X-射线衍射法是一种根据晶体中有序规则排列的原子会对X-射线产生规律性的衍射波的原理，通过计算机程序处理后得到各原子在分子中的位置，从而直接显示出分子结构，也就是说它能同时测定分子结构的全部信息，包括平面结构、相对构型。利用铜的Kα X-射线衍射测定甚至可以确定绝对构型。相关内容可以参阅有关文献和书籍，这里就不再赘述。