第三节 鱼病的实验室诊断

对于细菌性疾病和病毒性疾病来说，仅通过显微镜检查，还是无法确定是由哪一种细菌或病毒引起的，这时应进行实验室检查。实验室检查的目的是对细菌性疾病和病毒性疾病的病原体进行分离、培养与鉴定、药敏试验等，以确定致病病原体及它们对哪些药物敏感，可以用哪些药物来治疗这种鱼病。

一、病原体的分离鉴定

病原体的分离鉴定是传染病确诊的基础，也是疾病研究和确诊新病的基本方法。

1.病毒的分离鉴定

以无菌方法取患病生物的肝脏、脾脏、肾脏等内脏器官，剪碎、研磨或捣碎，用Hank′s液或生理盐水或磷酸盐缓冲液（pH 7.2）制成1∶10的匀浆，加入青霉素和链霉素，每毫升含量为800～1000国际单位（或微克），反复冻融3次，离心后取上清液，使其通过细菌滤器除菌，取滤液接种于敏感细胞或敏感生物，如果细胞出现细胞病变效应或生物出现与自然发病时相同的症状时即可证明病毒分离成功。要鉴定为何种病毒，需做电镜观察和特定试验，鉴定其核酸类型和生物学特性，对常见病毒最好用血清学实验或分子生物学实验方法进行快速鉴定。

2.细菌的分离鉴定

将濒死鱼在无菌环境下用无菌水洗净并用紫外线照射，彻底清除体表杂菌后，以无菌方法从病灶深层的器官或组织内部取样接种到适宜的培养基，经28℃培养1～2天，取单个菌落纯化后用于致病性试验和细菌鉴定试验。通过致病性试验，被接种生物如果出现与自然发病相似的症状，并且从人工感染发病的生物体上能分离得到与接种菌相同的菌种，即可验证此菌种为本病的病原菌。再根据细菌形态特征和生理生化特性或血清学实验，对其进行鉴定。

二、免疫学诊断技术

免疫学诊断技术，又称血清学检测技术。利用已知的病原生物或者其产物，可以制备成诊断抗原、诊断血清。用诊断抗原可以通过检测水产生物血清中的特异性抗体，确认被检生物是否感染某种病原体或曾被某种病原体感染过；而采用标记的高效价的特异性抗体检测水产生物的组织，可以确认被检生物体内是否存在某种疾病的病原体。无论是应用诊断抗原追踪抗体，还是应用诊断血清检测抗原，都是利用免疫学原理，即抗原和抗体在适宜条件下可以发生特异性反应的特性。利用这一特性，人们通过单克隆抗体技术、酶联免疫吸附测定、免疫荧光抗体技术及中和试验技术等技术来检测疾病。

1.单克隆抗体技术

单克隆抗体是由一个抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，再经大量繁殖而来的细胞群所产生的抗体。所以，与常规血清抗体相比，其特异性强，亲和性一致，还具有识别单一抗原决定簇的特性。

2.酶联免疫吸附测定（ELISA法）

ELISA的基本原理是：受检物中的抗原或抗体与固相表面的抗体或抗原发生免疫反应并结合在固相表面，此抗原抗体结合物又能结合相应的酶标记物，用洗涤法去除未结合而游离的酶标记物，继而加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，显色的程度与受检物中的抗原或抗体的量直接相关，由此可根据显色的深浅进行定性或定量的测定。

3.免疫荧光抗体技术

荧光抗体技术是最早使用的免疫诊断技术之一。本方法有免疫学反应的特异性和荧光技术的敏感性，可比较快速地监测出少量抗原或抗体在细胞内或组织中的定位分布。国外学者已将直接荧光抗体技术用于鱼类病原菌的鉴定、鱼体中病原菌的定位、鱼类病原菌数量的测定、病原菌血清型的鉴定及鱼类疾病的快速诊断。

4.中和试验技术

中和试验技术是测定鱼类的抗体或抗原中和抗原或抗体的能力。主要用于病毒鉴定和病毒性抗体的测定及查获无征象的带病鱼。

三、分子生物学诊断技术

1.聚合酶链式反应（PCR）

PCR技术是在引物指导下，依赖于模板和DNA聚合酶的酶促反应，它类似于生物体内的DNA复制，通过反复的变性、复性和延伸，在较短的时间内，可使微量DNA片断的目的基因数量呈几何级数扩增。因此，在掌握了病毒的DNA序列后，可设计特异性较强的引物，以极低的浓度扩增出大量的基因片断，从而达到检测的目的。

2.核酸杂交技术

核酸杂交技术，是随着基因工程技术的发展而发展起来的第三代诊断技术。该技术利用核苷酸碱基序列互补的原理，以标记的已知核酸片断，通过核酸杂交，来监测和鉴定样品中的未知核酸。与传统的诊断方法相比，核酸杂交技术具有快速、简便、敏感度高和特异性强的特点。

3.磁免疫PCR技术（MIPA）

MIPA技术综合了磁分离技术、免疫学技术和PCR技术，三者结合大大改善了诊断的速度。MIPA技术避免了免疫方法采用单克隆抗体识别抗原的复杂操作，也克服了DNA杂交的长时间和假阳性及操作设备要求高等缺点，因此具有独特的优点。磁免疫技术目前尚处于研究阶段，在水产上应用不是很多。

4.多重PCR技术

多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系中加上2对以上引物，同时扩增出多个核酸片断的PCR反应。多重PCR的用途主要有两方面：①多种病原微生物的同时检测或鉴定；②病原微生物的变异及分型鉴定、检测。