药物的毒性大部分是通过有毒物质与靶分子反应而产生的。有毒物质与靶分子结合后可继发一系列的生化反应，导致生物机体内不同水平的损伤或功能丧失，如靶分子本身、细胞器、细胞、组织和器官乃至整个机体。

所有内源性化合物都是药物潜在靶部位。最常见的与毒理学密切相关的大分子有核酸(尤其是DNA)、蛋白质，小分子中最常累及的是细胞膜的脂质类。活性代谢产物的第一个作用靶点为酶。并不是所有的靶部位经作用后都会产生有害效应，如药物及其代谢产物与蛋白质共价结合后可能不产生毒副反应，反而可能显现解毒作用。

药物及其代谢产物可与靶分子共价或非共价结合，也可通过去氢、电子转移或酶催化来改变靶分子。

非极性相互作用或氢键和离子键的形成都属于毒物与靶部位(如膜受体、细胞内受体、离子通道和一些酶)反应。非共价结合时键能相对较低，故通常是可逆的。

共价结合改变了内源性分子，它一般是不可逆的。其形式通常是与亲电性毒物结合，如非离子和阳离子的亲电基团以及阳离子基。这些毒物与亲核原子反应，这些原子在生物大分子如蛋白质和核酸中很多。HO·、·NO ₂和Cl ₃C·等中性自由基也可与生物分子共价结合。

中性自由基可使内源性化合物去掉氢原子后转变为自由基。自由基也可将从游离氨基酸的-CH ₂-基团或从蛋白质的氨基酸残基中去掉氢原子，使其转变为羰基，并与DNA或其他蛋白质形成交叉连接。

化学物质可通过交换电子氧化或还原其他分子而产生有害物质。例如，在高铁血红蛋白血症中，化学物质可将Fe ^{( 2+)}氧化为Fe ^{( 3+)}。

一些毒素在酶催化下作用于特定靶蛋白。例如，白喉毒素可破坏蛋白质合成过程中延长因子2的功能;霍乱毒素也是通过这一机制激活G蛋白。

因此，大多数有毒物质基于自身的化学活性与内源性分子反应。具有多种活性的有毒物质则可通过不同的机制与不同的靶分子产生作用。

一些毒物可通过模拟内源性受体激活蛋白质靶分子。较常见的是化学物质通过阻断神经递质受体、离子通道或抑制酶活性而抑制靶分子的功能。

蛋白质与有毒物质相互作用后，形态和结构发生改变而使其功能受损。许多蛋白质具有关键部位，这对于催化活性和蛋白质大分子复合物的组装是必要的条件。这些部位与外源性物质共价结合或氧化修饰后会引起信号转导偏离和(或)细胞能量维持和代谢平衡被破坏。有毒物质亦可影响DNA的模板功能。化学物质与DNA的共价结合可引起核苷酸的配对错误。例如，黄曲霉毒素8，9-氧化物共价结合于鸟嘌呤的N-7位使得带有加合物的鸟嘌呤与腺嘌呤配对而不是与胞嘧啶配对，导致不正确密码的形成及不正确的氨基酸插入蛋白质。这样的情形是黄曲霉毒素诱发 ras原癌基因及 p53肿瘤抑制基因突变的常见因素。

除了形成内聚物，有毒物质也可通过交叉连接和裂解改变内源性分子的基本结构。交叉连接使分子链结构和功能受到限制。

在受到化学物质进攻后，其他靶分子也易受影响而自发降解。自由基如Cl ₃COO·和HO·可通过从脂肪酸中去掉氢而使脂质发生过氧化降解，破坏细胞膜内脂质，产生内源性脂质自由基和亲电基团，并进一步破坏DNA的结构。

毒物可引起几种形式的DNA断裂。例如，DNA碱基受HO·攻击可形成咪唑环开放的嘌呤或环收缩的嘧啶，这将阻断DNA复制。在鸟嘌呤N-7位置上大块加合物的形成使N-糖苷链不稳定，诱发脱嘌呤作用，脱嘌呤作用导致具有致突变作用的无嘌呤部位的形成。很具代表性的是，羟自由基通过从DNA的核糖提取H，产生C-4’自由基，随后发生 加成重排( Criegee)和磷酸二酯链的断裂而引起单链断裂。多种羟自由基攻击长度较短的DNA(这种情况发生在电离辐射后)引起双链断裂，这对于受影响细胞常表现为致死效应。

药物及其代谢产物与蛋白质的共价结合可能会引起免疫反应。一些化学物质(如青霉素、二硝基氯苯)可以与蛋白质自发结合，从而激发免疫应答。其他物质可能通过自身氧化成为醌类(如漆酚、毒常春藤过敏原)或通过酶的生物转化而获得活性，其中部分能成为新的抗原。

药物及其代谢产物可使生物微环境发生以下改变，从而产生毒性作用:①改变氢离子浓度;②溶剂和洗涤剂改变细胞膜脂质的理化性质，破坏跨膜溶剂梯度;③外源性物质通过占领位点或空间产生危害。药物及其代谢产物与非靶分子反应产生毒性也叫脱靶( off target)效应。