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第五节 病原微生物检查
睾丸、附睾、精囊腺、前列腺等与精子生成、成熟或运输有关的器官发生感染可影响精子的数量与质量。常见引起生殖道感染的病原体有葡萄球菌、链球菌、肠球菌、肠杆菌科细菌、不动杆菌、乳杆菌、支原体、衣原体、非致病性奈瑟菌、念珠菌、病毒等。可取尿道口分泌物、前列腺按摩液、精液进行检查。
一、 精液细菌、真菌的实验室检查
（一） 精液细菌、真菌的显微镜直接检查 1. 精液标本的收集
按WHO标准，禁欲3～7天，采集前排小便，洗净双手，用0.01%的苯扎溴铵消毒尿道外口，用无菌生理盐水反复冲洗阴茎、阴囊，以手淫法将精液收集于无菌瓶中。
2. 显微镜检查
精液、前列腺按摩液进行显微镜检查是检查精液是否染菌最常用的方法。
（1） 精液涂片、固定、革兰染色镜检：
1） 革兰染色原理：革兰染色的结果取决于细菌细胞壁的结构：①G +菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。②G -菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
2） 试剂：①结晶紫（crystal violet）液：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸铵水溶液80ml，将两液混匀置24小时后过滤即成。此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。②碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300ml即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。③95%乙醇。④稀释苯酚复红溶液：碱性复红乙醇饱和液（碱性复红1g，95%乙醇10ml，5%苯酚90ml混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液），取苯酚复红饱和液10ml加蒸馏水90ml即成。⑤番红溶液：番红O（safranine，又称沙黄O）2.5g，95%乙醇100ml，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
3） 方法：革兰染色法包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤：①涂片固定；②草酸铵结晶紫染1分钟；③自来水冲洗；④加碘液覆盖涂面染1分钟；⑤水洗，用吸水纸吸去水分；⑥加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分；⑦番红染色液（或沙黄）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
4） 结果：G -被染成蓝紫色，G +被染成淡红色。
5） 注意事项：①新配制的染液应先用已知的G +菌和G -菌作对照，以检查染液质量。②革兰染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，G +菌也可被脱色而染成G -菌；如脱色时间过短，G -菌也会被染成G +菌。
（2） 精液的抗酸染色镜检：
1） 抗酸染色原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与苯酚复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。
2） 试剂：①苯酚复红液：称碱性复红4g，溶于95%乙醇100ml内，即成碱性复红饱和乙醇溶液。取该饱和溶液10ml，与50g/L的苯酚水溶液90ml混匀。②复染液：称亚甲蓝2g，溶于95%乙醇100ml中制成饱和溶液；再取该饱和溶液30ml加入蒸馏水100ml及100g/L的氢氧化钾水溶液0.1ml即成。③脱色液（3%盐酸乙醇）：浓盐酸3ml 加95%乙醇97ml。
3） 方法：夹住精液涂片，滴加苯酚复红染色，加温至有蒸汽出现，勿煮沸；染5分钟，流水冲洗，3%盐酸乙醇脱色；水洗后，亚甲蓝复染1分钟；水洗，干后，油镜检查。
4） 结果：红色为抗酸性细菌，蓝色为非抗酸性细菌或细胞。
5） 注意事项：苯酚复红加温染色过程中，温度不宜过高，勿使染料蒸干。
（二） 精液细菌、真菌的培养 1. 常用细菌培养基 （1） 血液琼脂（血平板）
1） 成分：普通营养琼脂95ml，脱纤维羊血（或兔血）5ml。
2） 配制：将已灭菌的普通营养琼脂（pH为7.6）加热熔化，冷却至50℃左右，以无菌手续加入纤维羊血（临用前置37℃水浴箱预温），轻轻摇匀（勿使有气泡），倾注于灭菌平皿内，每一平皿（直径9cm）20ml或分装试管，等凝固后，抽样置35℃培养，18～24小时，观察有无细菌生长，如无细菌生长，置4℃备用。
（2） 巧克力色血琼脂（分离嗜血杆菌用）
1） 成分：氯化钠2.5g，蛋白胨5.0g，牛肉粉2.5g，酵母浸膏2.5g，蒸馏水500ml（以上成分亦可用营养琼脂或哥伦比亚琼脂），氯化血红素15mg，25mg/ml万古霉素，7.5g/L辅酶A（NAD）。
2） 配制：称取上述成分后，加蒸馏水溶解，用少量0.25mol/L氢氧化钠溶解氯化血红素后加入培养基，调pH7.8，高压灭菌，至60℃左右加入30ml羊血，置85℃水浴中摇动10～15分钟，冷至50℃左右加入上述浓度万古霉素、NAD各1ml。摇匀后倾注平板，抽样做无菌实验后，4℃保存备用。
（3） 麦康凯琼脂：
分离革兰阴性杆菌用。称取麦康凯琼脂，加蒸馏水溶后，高压灭菌，倾注平皿。
（4） 罗氏培养基（改良）：
分离结核分枝杆菌。
1） 成分：谷氨酸钠（99%以上）7.2g，磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，枸橼酸镁0.6g，甘油12ml，马铃薯淀粉30g，蒸馏水600ml，新鲜全蛋液1000ml，2%孔雀绿水溶液20ml。
2） 配制：①基础液制备：量取蒸馏水600ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和甘油，沸水浴使其溶解，自然冷却。②新鲜全蛋液制备：洗净新鲜鸡蛋表面，浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20～30分钟。取出，擦干，开口，收集鸡蛋液，搅匀。通过消毒的纱布过滤。③将600ml基础液和1000ml新鲜全蛋液混匀。加入2%孔雀绿水溶液20ml，混匀，静置1小时后，分装至标准螺旋盖。
2. 常用真菌培养基 （1） 沙保弱培养基
1） 成分：蛋白胨10g，琼脂20g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml。
2） 配制：上述成分混合，加热溶解分装，高压灭菌15分钟，倾注平皿。
（2） 念珠菌显色培养基
配制：称取柯玛素显色培养基，加蒸馏水后，高压灭菌，冷至50℃左右倾注平皿。
3. 精液中常见细菌、真菌的鉴定
细菌培养：以无菌技术将待测精液接种于血平板、巧克力平板，或加上麦康凯平板。接种后的培养基置35℃温箱，在分离培养某些细菌（如淋病奈瑟菌）时，需将已接种的培养基置5%～10% CO 2的环境。
（1） 淋病奈瑟菌：
将精液接种于巧克力平板，5%～10% CO 2的环境中35℃培养24～48小时后，取生长的可疑菌落涂片革兰染色，油镜下观察是否为革兰阴性，肾形成双排列，并取可疑菌落做氧化酶、糖发酵实验，并可进一步用荧光抗体实验等鉴定。对初步认定的菌落可先用头孢硝噻吩纸片检测β-内酰胺酶，并做规定的抗生素敏感实验。
（2） 革兰阴性杆菌：
取平板上分离的纯菌落，革兰染色镜检为革兰阴性杆菌，按细菌生化鉴定程序操作，并进行药敏实验。
（3） 葡萄球菌：
根据涂片、染色检查结果作血浆凝固酶、甘露醇发酵实验、耐热核酸酶实验、葡萄球菌A蛋白检测等。
（4） 链球菌：
根据涂片、染色可见链状排列的革兰阳性菌。血平板培养有助于识别溶血特征，挑选可疑菌落进行血清学分类鉴定、杆菌肽、Optochin等实验鉴定。
（5） 厌氧菌培养：
按厌氧菌培养的要求收集标本，并立即送厌氧培养。
（6） 结核分枝杆菌培养：
标本收集后，自行液化接种于罗氏培养基，置35℃培养约2个月，培养期间每周观察结果。发现可疑菌落，作涂片抗酸染色确认。
（7） 真菌培养：
取精液接种于沙保弱培养基或念珠菌显色培养基进行培养鉴定。
二、 精液支原体、衣原体的实验室检查
（一） 衣原体检查 1. 衣原体培养
由于沙眼衣原体是在细胞内寄生，所以它只能在组织中培养。衣原体的培养取材一般应在男性的尿道深入0.5cm以上，培养法的方法较复杂，虽然是诊断的金标准，但临床较少应用。
2. 直接荧光抗体检测
是一种应用荧光素标记抗体，可用于在标本直接涂片染色、在荧光显微镜下检测衣原体的方法。
3. 酶标免疫反应
应用单克隆或多克隆抗体检测衣原体的脂多糖。目前主要是对沙眼衣原体的检测。
4. PCR检测
PCR技术可将目标DNA或RNA序列成百万倍放大，使敏感性大大提高。
5. 核酸杂交技术
应用特异性探针与模板中特定序列进行杂交，大大提高了检测的敏感性。
（二） 解脲支原体的培养
解脲支原体也称解脲脲原体（M.urealyticum）与人类泌尿生殖道感染有密切关系。能利用自身的尿素酶，分解尿素后以提供代谢的能源。
（1） 液体培养基成分：
牛肉浸液70ml（可用进口牛肉粉替代），蛋白胨1.0g，NaCl 10.5g，KH 2PO 4 0.15g，4.0g/L酚磺酞0.5ml。目前有市售。
（2） 方法：
将标本接种于液体培养基内，置35℃5% CO 2培养箱培养；分别于24小时、48小时、72小时观察结果；如果解脲脲原体生长，则水解尿素，使培养基pH升高，液体变红色。
三、 梅毒实验室检查
（一） 梅毒螺旋体检查
此法最适一期梅毒，其次为二期梅毒。
1. 暗视野显微镜检查
在皮损处，用玻片刮取组织渗出液或淋巴结穿刺液，置暗视野或相差显微镜下观察，见有活动的梅毒螺旋体为阳性。
2. 免疫荧光染色
在荧光显微镜下可见绿色的梅毒螺旋体。
3. 活体组织检查梅毒螺旋体
如用银染色法（warthin-starry）法或荧光抗体染色，可查见梅毒螺旋体，呈黑褐色，有螺旋结构，位于真皮毛细血管周围。银染色的阳性结果需谨慎解释，因为类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆。而特异性荧光检查则更为可靠。
（二） 梅毒血清学实验
一般在感染梅毒2周后才出现阳性。根据所用抗原不同，梅毒血清实验分为非梅毒螺旋体抗原血清实验、梅毒螺旋体抗原血清实验两大类。
1. 非梅毒螺旋体抗原血清实验
用心磷脂作抗原，测定血清中抗心磷脂抗体，亦称反应素。本实验敏感性高而特异性较低，且易发生生物学假阳性。早期梅毒患者经充分治疗后，反应素可以消失，早期未经治疗者到晚期，部分患者中反应素也可以减少或消失。目前一般作为筛选和定量实验，观察疗效，复发及再感染。
（1） 性病研究实验室实验（venereal disease research laboratory test，VDRL）：
用心磷脂、卵磷脂及胆固醇为抗原，可做定量及定性实验，试剂及对照血清已标准化，费用低。此法常用，操作简单，需用显微镜读取结果，缺点是一期梅毒敏感性不高。
（2） 快速血浆反应素实验（rapid plasma reagin test，RPR）：
是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似，优点是肉眼即可读出结果。
（3） 不加热血清反应素玻片实验（unheated serum reagin，USR）：
也 是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似。
（4） 甲苯胺红不加热血清实验（toluidine red unheated-serum test，TRUST）：
VDRL抗原的改良，此法常用，操作简单，优点是肉眼即可读出结果。
2. 梅毒螺旋体抗原血清实验
用活的或死的梅毒螺旋体或其成分来做抗原测定抗螺旋体抗体。这种实验敏感性和特异性均高，一般用作证实实验。这种实验是检测血清中抗梅毒螺旋体IgG抗体，即使患者经过足够治疗，仍能长期存在，甚至终身不消失，血清反应仍持续存在阳性。因此，不能用于观察疗效。
（1） 荧光梅毒螺旋抗体吸收实验（FTA-ABS）：
此法是较敏感和较特异的螺旋体实验。
（2） 梅毒螺旋体血凝实验（TPHA）：
敏感性和特异性均高，操作简便，但对一期梅毒不如FTAABS实验敏感。
3. 梅毒螺旋体制动实验（TPI）
用nichol株螺旋体（活的）加患者血清（含抗体）后，在补体的参与下可抑制螺旋体的活动。如≥50%梅毒螺旋体停止活动，则为阳性。此实验特异性、敏感性均高，但设备要求高，操作难，仅供研究用。
四、 生殖器病毒感染的实验室检查
（一） 单纯疱疹病毒感染的检查
单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是疱疹病毒科的成员，属DNA病毒。目前，疱疹病毒感染的常用实验方法有：病毒分离；病毒或病毒抗原测定：免疫电镜、细胞学方法、免疫荧光法、对流免疫电泳及ELISA方法等；抗体测定：补体结合实验（cF）、中和实验（NT）、免疫荧光实验（IFA）、间接血凝实验（IHA）、ELISA和放射免疫实验（RIA）等。
（二） 巨细胞病毒感染的检查
1. HCMV组织培养方法
（1） 培养基：①RPMI 1640液，加入20%小牛血清，即常用的细胞培养液；②实验用细胞系：HDEL，即人二倍体胚肺细胞系。
（2） 实验标本：精液、尿、血液等，均可用于本实验。
（3） 操作方法：将HDEL细胞系培养于含20%小牛血清的RPM ll640液中，待HDEL细胞系长成细胞单层后，将患者新鲜精液，经处理后（高速离心沉淀）接种人胚肺成纤维细胞，定期观察细胞病变（CPE）情况。如有CPE产生，证明原培养物中HcMV阳性；10天后，若无cPE，将细胞盲传1次，仍无cPE，可报告HcMv培养阴性。
2. HCMV抗体检测 HcMV抗体检测的方法较多，包括补体结合实验（CF）、间接血凝实验（IHA）、免疫荧光实验（IFA）、免疫印迹实验（IB）、酶联免疫吸附实验（ELISA）及放射免疫实验（RIA）等。
3. HCMV DNA的PCR测定方法。
（三） 风疹病毒感染的检查
风疹病毒感染的常见检查的实验室检查有：血凝抑制实验、间接EL-SA法IgG抗体、捕获ELISA法测定IgM抗体、风疹病毒RNA的PCR测定。